Introduction
Les nouveaux virus, appelés virus émergents, constituent une menace pour la santé humaine d’une ampleur qui ne doit pas être sous-estimée. Ces virus ont acquis la capacité d’infecter l’être humain soit à la suite d’une transmission interespèces, soit en raison de modifications naturelles du génome viral¹. Les infections causées par les virus émergents entraînent souvent des maladies graves, voire la mort, car le système immunitaire humain peut ne pas être en mesure de lutter contre un virus inconnu, en particulier lorsqu’il est d’origine zoonotique (voir la littérature pour plus d’informations²).
Divers facteurs favorisent l’apparition et la propagation des virus émergents³. Ceux-ci incluent des facteurs écologiques, tels que la déforestation visant à acquérir de nouvelles terres pour le développement, ainsi que notre mode de vie caractérisé par la mobilité mondiale et le commerce international. Ainsi, la perte d’habitat augmente la probabilité que les humains, les animaux de compagnie et les animaux d’élevage entrent en contact avec des espèces sauvages qui vivaient à l’origine dans des zones isolées et qui n’avaient donc pas été auparavant identifiées comme des hôtes naturels de virus émergents. En outre, les conditions propres à une société mondialisée, impliquant une augmentation des déplacements, permettent également la dissémination de virus pathogènes à travers le monde, même avant l’apparition de symptômes cliniques.
Au cours des 100 dernières années, de multiples introductions de virus émergents dans la population humaine ont eu lieu, entraînant des épidémies locales ou des flambées mondiales (pandémies ; voir Tableau 1). En particulier, le virus Ebola a récemment suscité des inquiétudes à l’échelle mondiale, l’épidémie d’Ebola en Afrique de l’Ouest, qui a coûté la vie à plus de 11 000 personnes, ayant démontré de manière dramatique le danger posé par les virus émergents⁴. La recherche impliquant des virus émergents est souvent limitée aux laboratoires de haute sécurité de niveaux de biosécurité (BSL) 3 et 4 (voir Tableau 1). Le travail dans des laboratoires BSL-4 est extrêmement exigeant, coûteux et autorisé uniquement dans un nombre restreint de sites, ce qui rend difficile l’obtention de progrès scientifiques rapides dans la caractérisation des agents pathogènes viraux et le développement de médicaments antiviraux.
Dans ce contexte, les pseudotypes viraux offrent une option attrayante pour étudier de manière sûre et efficace l’entrée des virus hautement pathogènes dans les cellules. Cela est possible car l’agent pathogène entier n’est pas analysé, mais uniquement les composants impliqués dans l’entrée dans la cellule hôte, à savoir les protéines d’enveloppe. Celles-ci constituent la clé de l’entrée virale dans les cellules. Dans le cas des pseudotypes viraux, les protéines d’enveloppe de virus hautement pathogènes sont incorporées dans un virus porteur (pseudotypage) incapable de se répliquer de manière autonome, c’est-à-dire déficient pour la réplication. Les systèmes couramment utilisés pour le pseudotypage reposent sur des rhabdovirus (par exemple le virus de la stomatite vésiculeuse, VSV ; Fig. 1) et des rétrovirus.
L’objectif de cette étude était de vérifier si l’entrée médiée par les protéines d’enveloppe des pseudotypes viraux reflète l’entrée dans la cellule hôte des virus intacts. En outre, cette étude visait à déterminer l’influence du niveau de pureté des réactifs utilisés, en l’occurrence l’eau de laboratoire, sur la production des pseudotypes viraux.
Matériels et méthodes
Culture cellulaire, plasmides d’expression et transfection: Les cellules HEK-293T, MDCKII et Vero E6 ont été incubées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) et 1 % de solution pénicilline/streptomycine à 37 °C et 5 % de CO₂. Pour le repiquage et l’ensemencement, les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et détachées par incubation avec de la trypsine | EDTA.
Pour produire des pseudotypes du VSV, des plasmides codant les protéines d’enveloppe virales suivantes ont été utilisés comme vecteurs d’expression : la glycoprotéine du VSV (VSV G), la glycoprotéine du virus Ebola (EBOV GP), la glycoprotéine de spicule du coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV S), l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) du virus de la grippe A responsable de la pandémie de la « grippe espagnole », H1N1 (1918). En outre, un plasmide d’expression pour la dipeptidyl-peptidase 4 (DPP4) a été utilisé. Un plasmide d’expression vide a servi de contrôle. Les cellules HEK-293T ont été transfectées par précipitation calcium | phosphate, tous les tampons et solutions étant préparés soit avec de l’eau déminéralisée, soit avec de l’eau ultrapure Sartorius Arium Pro VF.
Production d’eau ultrapure
L’eau ultrapure Arium Pro VF utilisée a été produite selon la méthode décrite par Nitzki et Herbig (2013)⁵. Cette eau présente une teneur en TOC (carbone organique total, c’est-à-dire carbone lié organiquement) inférieure à 2 ppb et une conductivité de 0,055 μS/cm (correspondant à une résistivité de 18,2 MΩ × cm), compensée à 25 °C.
Production des pseudotypes du VSV
Pour la génération des pseudotypes du VSV, un vecteur VSV déficient pour la réplication a été utilisé, dans lequel l’information génomique de la glycoprotéine du VSV, VSV G, a été remplacée par deux gènes rapporteurs, à savoir des cadres de lecture ouverts (ORF) codant la protéine fluorescente verte (GFP) et la luciférase de luciole (fLUC). Pour propager ce virus (VSV*ΔG-fLUC), la VSV G doit être fournie en trans (par exemple par transfection d’un plasmide d’expression). Les pseudotypes du VSV ont été produits comme décrit par Hoffmann et al. (2016)⁶.
Prétraitement des cellules cibles par la sialidase ou des inhibiteurs:
Les cellules MDCKII ont été traitées avec 200 mU de sialidase recombinante afin d’éliminer les acides sialiques terminaux des glycoprotéines et glycolipides de la membrane plasmique. Afin de déterminer si l’entrée des pseudotypes du VSV médiée par les protéines d’enveloppe dépend d’un pH acide et de l’activité des protéases cystéiniques cellulaires, les cellules Vero E6 ont été incubées avec 50 nM de bafilomycine A1 ou 50 μM de E-64d. Les composés ont été dilués dans le milieu de culture cellulaire ; l’incubation a été réalisée pendant 2 heures à 37 °C et 5 % de CO₂. Les cellules non traitées ont servi de contrôles.
Analyse de l’entrée dans la cellule hôte médiée par les protéines d’enveloppe:
Les cellules cibles ont été incubées avec les pseudotypes du VSV pendant 1 heure, puis lavées avec du PBS et incubées de nouveau dans le milieu de culture cellulaire pendant 16–20 heures. Les cellules ont ensuite été lysées à l’aide d’un tampon de lyse pour la luciférase, et l’activité de la luciférase dans les lysats cellulaires a été mesurée à l’aide d’un chimiluminomètre et de kits d’analyse disponibles dans le commerce afin d’évaluer l’efficacité de la transduction (c’est-à-dire l’entrée des pseudotypes dans la cellule hôte) médiée par les protéines d’enveloppe.
Résultats
Il est connu que le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV, anciennement appelé coronavirus humain, EMC = hCoV-EMC) se lie à la surface cellulaire par l’interaction entre la glycoprotéine de spicule virale (S) et la protéine membranaire cellulaire dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), permettant ainsi l’entrée dans la cellule⁷. Afin de vérifier si ce mécanisme s’applique également dans le contexte des pseudotypes du VSV, les cellules cibles ont été transfectées avec un vecteur d’expression pour DPP4 ou avec un plasmide d’expression vide (absence de récepteur). Comme prévu, l’expression dirigée de DPP4 a entraîné une augmentation significative de l’entrée dans la cellule hôte des pseudotypes de VSV lorsque ceux-ci incorporaient la protéine S du MERS-CoV dans leur enveloppe (voir Fig. 2A).
Les virus de la grippe A, agents responsables de la maladie grippale, nécessitent des structures glucidiques terminales, appelées acides sialiques, présentes comme modifications naturelles des glycoprotéines et glycolipides de la membrane cellulaire, en tant que récepteurs pour médiatiser l’entrée dans les cellules cibles (voir la littérature pour plus d’informations⁸). Afin d’étudier si l’incorporation des protéines d’enveloppe du virus de la grippe A dans des pseudotypes du VSV conduit également à une entrée cellulaire dépendante des acides sialiques, des pseudotypes de VSV portant HA/NA de H1N1 (1918) ont été utilisés, et les acides sialiques ont été éliminés enzymatiquement de la surface des cellules cibles. Comme attendu, l’élimination des acides sialiques a entraîné une diminution drastique de l’entrée dans la cellule hôte des pseudotypes de VSV contenant HA/NA de H1N1 (1918) dans leur enveloppe (voir Fig. 2B). Cette observation confirme que les pseudotypes viraux reproduisent le mécanisme d’entrée des virus authentiques de la grippe A dans les cellules.
L’activation de la glycoprotéine du virus Ebola lors de l’entrée cellulaire est dépendante du pH et nécessite l’activité de protéases cystéiniques
La glycoprotéine du virus Ebola (EBOV GP) subit des modifications post-traductionnelles lui conférant de multiples oligosaccharides, et cette forte densité de glycannes est supposée protéger le virus d’une détection efficace par le système immunitaire humain⁹. Toutefois, lors de l’entrée dans la cellule hôte, une partie de l’EBOV GP contenant la majorité des modifications glucidiques doit être éliminée¹⁰. Cet amorçage fonctionnel est médié par des protéases cystéiniques cellulaires¹¹ présentes dans les vésicules endosomales et actives uniquement à un pH endosomal faible.
Nous avons ensuite examiné si l’entrée médiée par l’EBOV GP des pseudotypes du VSV dépend également de l’activité des protéases cystéiniques cellulaires et d’un pH bas. À cette fin, des pseudotypes du VSV incorporant l’EBOV GP dans leur enveloppe ont été produits puis utilisés pour inoculer des cellules cibles préalablement incubées avec de la bafilomycine A1 (qui empêche l’acidification des endosomes par inhibition des pompes à protons) ou avec un inhibiteur de protéases cystéiniques (E-64d). Les résultats ont montré que l’entrée cellulaire médiée par l’EBOV GP dans le contexte des pseudotypes du VSV dépend également d’un environnement acide (voir Fig. 3A) et de l’activité des protéases cystéiniques (voir Fig. 3B). En outre, nous avons démontré que le traitement par E-64d bloque spécifiquement l’entrée cellulaire médiée par l’EBOV GP, car l’entrée des pseudotypes médiée par la VSV-G est indépendante des protéases cystéiniques, bien qu’elle dépende d’un pH endosomal faible.
Le niveau de pureté de l’eau de laboratoire utilisée influence la qualité des pseudotypes du VSV
Après avoir démontré lors des essais précédents que les pseudotypes du VSV constituent des modèles appropriés pour l’étude de l’entrée dans la cellule hôte de virus hautement pathogènes, la question suivante à clarifier concernait l’influence spécifique du niveau de pureté de l’eau de laboratoire utilisée sur la qualité des pseudotypes du VSV. Lors de la production des pseudotypes du VSV, divers tampons et solutions sont employés, tous préparés à partir d’eau. Toutefois, il convient de noter que n’importe quel type d’eau ne convient pas à la préparation de ces réactifs. Il est au contraire essentiel de choisir le niveau de pureté approprié pour une utilisation en laboratoire.
Afin d’examiner si l’utilisation d’eau ultrapure permet d’obtenir des pseudotypes du VSV de meilleure qualité, deux lots de pseudotypes du VSV ont été générés en parallèle : un lot a été préparé en utilisant de l’eau déminéralisée provenant d’un système central d’approvisionnement en eau du laboratoire (conductivité de 3,7–4,1 μS/cm à 19 °C) comme solvant de base pour toutes les solutions et tampons, tandis qu’un autre lot a été produit à partir de solutions et de tampons préparés avec de l’eau ultrapure Arium Pro VF (conductivité de 0,055 μS/cm compensée à 25 °C). Les protéines d’enveloppe EBOV GP et MERS-CoV S ont été étudiées. Après une production parallèle des pseudotypes du VSV dans des conditions d’incubation identiques, les cellules cibles ont été inoculées et l’entrée des pseudotypes du VSV médiée par les protéines d’enveloppe a été quantifiée.
Ce dispositif expérimental a montré que l’entrée dans la cellule hôte (en tant que paramètre de la qualité) des pseudotypes du VSV produits à l’aide de l’eau ultrapure Arium Pro VF comme solvant de base pour tous les tampons et solutions était significativement plus élevée que celle des pseudotypes dont la production reposait sur l’utilisation d’eau déminéralisée (Fig. 4).
Discussion
Au cours de cette étude, des pseudotypes viraux ont été produits sur la base d’un virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) déficient pour la réplication, et les protéines d’enveloppe de divers virus hautement pathogènes ont été étudiées. Nous avons montré que l’entrée dans la cellule hôte reposait sur les mêmes molécules réceptrices et les mêmes processus biochimiques que ceux décrits pour les virus authentiques. En outre, nous avons démontré que l’utilisation d’eau ultrapure pour la production des pseudotypes du VSV permettait d’optimiser ce processus. De futures investigations devraient être conçues afin de clarifier l’origine de cette observation : est-elle due à une quantité accrue de pseudotypes du VSV produits, à une entrée cellulaire plus efficace ou à une stabilité améliorée des pseudotypes ? Par exemple, on peut supposer que l’absence de sels, de protéinases ou de lipases lors de l’utilisation d’eau ultrapure augmente la stabilité des pseudotypes du VSV.
En conclusion, il peut être affirmé que les pseudotypes viraux constituent des outils importants pour l’étude de l’entrée dans la cellule hôte de virus hautement pathogènes. Étant donné que ces pseudotypes viraux ne limitent pas la recherche sur ces virus hautement pathogènes aux laboratoires de niveaux de biosécurité BSL-3 ou BSL-4, un plus grand nombre d’installations scientifiques peuvent mener ce type de recherches.
Il en résulte que l’entrée cellulaire des virus émergents peut être caractérisée et que des procédures de détection appropriées ainsi que des stratégies antivirales (médicaments, vaccins) peuvent être développées plus rapidement. L’utilisation de pseudotypes réduit également l’importante charge de travail requise dans les laboratoires de haute sécurité nécessitant des combinaisons de protection intégrale, ainsi que les coûts élevés et les contraintes inhérentes à ce type de travail (par exemple, l’absence d’accès à des équipements qui ne sont pas directement situés dans le laboratoire de haute sécurité). En outre, comparés aux virus authentiques hautement pathogènes, les pseudotypes viraux minimisent le risque d’infection du personnel de laboratoire en cas d’exposition accidentelle, représentant ainsi un aspect majeur en matière de sécurité.
L’optimisation du processus de production, par exemple par l’utilisation de réactifs de très haute pureté, en particulier ceux à base d’eau, peut en outre contribuer à améliorer la sensibilité des procédures de test ultérieures, à augmenter les rendements de production et ainsi à réduire davantage les coûts de production.
Références
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2 Mandl, J. et al. Reservoir host immune responses to emerging zoonotic viruses. Cell 2015; 160: 20–35.
3 Morse, S. S. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerging Infectious Diseases 1995; 1: 7–15.
4 Shiwani, H. A. et al. An update on the 2014 Ebola outbreak in Western Africa. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2017; 10: 6–10.
5 Nitzki, F., Herbig, E. In situ Hybridisierung – Die Bedeutung von Reinstwasser für RNA Technologien”, GIT Labor-Fachzeitschrift 57. Jahrgang, 3; 2013 [also available in English: In Situ Hybridization: The Importance of Ultrapure Water for RNA Technologies].
6 Hoffmann, M. et al. The glycoproteins of all filovirus species use the same host factors for entry into bat and human cells but entry efficiency is species dependent. PLoS One; 2016, Vol. 11.
7 Raj, V. S. et al. Dipeptidyl peptidase 4 is a functional receptor for the emerging human coronavirus-EMC. Nature 2013; 495: 251–254.
8 De Graaf, M., Fouchier, R. A. M. Role of receptor binding specificity in influenza A virus transmission and pathogenesis. The EMBO Journal 2014; 33: 781–935.
9 Cook, J. D., Lee, J. E. The secret life of viral entry glycoproteins: Moonlighting in immune evasion. PLoS Pathogens 2013; Vol. 9.
10 White, J. M., Schornberg, K. L. A new player in the puzzle of filovirus entry. Nature Reviews Microbiology 2012; 10: 317–322.
11 Chandran, K. et al. Endosomal proteolysis of the Ebola virus glycoprotein is necessary for infection. Science 2005; 308: 1643–1645.
