Réactifs et kits de purification des protéines

La purification des protéines peut être réalisée par différentes méthodes, chacune exploitant différentes propriétés des protéines. Voici cinq méthodes courantes :

1. Chromatographie d'affinité
   Utilise des interactions spécifiques entre la protéine d'intérêt et un ligand attaché à une résine de chromatographie. Les protéines marquées His se lient à la résine Ni-NTA, interactions anticorps-antigène. Les avantages de cette méthode sont une grande spécificité et un rendement élevé, souvent aboutissant à une grande pureté.

2. Chromatographie d'échange d'ions
   Sépare les protéines en fonction de leur charge. Les protéines se lient à une résine chargée et sont éluées en modifiant la concentration en sel ou le pH. Exemple : résines DEAE (échangeur d'anions) et CM (échangeur de cations). Cette méthode est efficace pour séparer les protéines ayant des points isoélectriques (pI) différents.

3. Chromatographie par exclusion de taille (filtration sur gel)
   Sépare les protéines en fonction de leur taille. Les protéines plus grandes éluent en premier car elles ne pénètrent pas dans les pores de la résine, tandis que les protéines plus petites éluent plus tard. Exemples : résines Sephadex, Superdex et Bio-Gel. Cette méthode est utile pour le désalage et l'échange de tampons, ainsi que pour déterminer le poids moléculaire.

4. Chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC)
   Sépare les protéines en fonction de leur hydrophobicité. Les protéines se lient à une résine hydrophobe dans des conditions de haute salinité et sont éluées en diminuant la concentration en sel. Exemples : résines Phenyl-Sepharose et Octyl-Sepharose. Cette méthode est efficace pour séparer les protéines ayant des degrés d'hydrophobicité variables.

5. Électrophorèse
   Sépare les protéines en fonction de leur taille et de leur charge en appliquant un champ électrique. Le SDS-PAGE est couramment utilisé pour séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Exemples : SDS-PAGE (dénaturant), Native PAGE (non-dénaturant) et IEF (focalisation isoélectrique). Cette méthode offre une haute résolution et est largement utilisée à des fins analytiques pour évaluer la pureté et le poids moléculaire.

Chacune de ces méthodes peut être utilisée individuellement ou en combinaison pour atteindre le niveau de pureté et de rendement souhaité pour la protéine cible.

L'EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) est couramment utilisé dans la purification des protéines pour plusieurs raisons :

• Agent chélatant : L'EDTA est un puissant agent chélatant qui se lie aux ions métalliques tels que le calcium, le magnésium et le fer. En chélatant ces ions, l'EDTA les empêche d'interférer avec le processus de purification des protéines
• Inhibition des métalloprotéases : De nombreuses protéases nécessitent des ions métalliques pour leur activité. L'EDTA inhibe ces métalloprotéases en se liant aux ions métalliques, protégeant ainsi les protéines cibles de la dégradation protéolytique pendant la purification
• Prévention de l'agrégation : Les ions métalliques peuvent parfois provoquer l'agrégation des protéines. En éliminant ces ions, l'EDTA aide à maintenir la solubilité et la stabilité des protéines
• Élimination des protéines contaminantes : Certaines protéines contaminantes peuvent se lier aux ions métalliques et être co-purifiées avec la protéine cible. L'EDTA peut aider à éliminer ces contaminants en perturbant leurs interactions dépendantes des ions métalliques

Globalement, l'EDTA est utilisé pour améliorer le rendement et la pureté de la protéine cible en minimisant la dégradation, l'agrégation et la contamination.

Prévenir l'agrégation des protéines pendant la purification est essentiel pour maintenir la solubilité et la fonctionnalité des protéines. Voici des stratégies spécifiques que vous pouvez mettre en œuvre tout au long du processus de purification :

Optimiser les conditions initiales

• pH du tampon : Sélectionnez un pH de tampon proche du pH de stabilité maximale de la protéine, généralement légèrement éloigné de son point isoélectrique (pI)
• Force ionique du tampon : Utilisez des concentrations appropriées de sels (par exemple, NaCl) pour stabiliser la protéine et réduire les interactions électrostatiques

Utilisation d'additifs

• Détergents : Les détergents non ioniques comme Triton X-100, Tween-20 ou CHAPS peuvent aider à stabiliser les protéines membranaires et à prévenir l'agrégation
• Osmolytes : Les additifs comme le glycérol (5-20%), le saccharose ou le tréhalose peuvent stabiliser les protéines par hydratation préférentielle
• Agents réducteurs : Incluez le DTT (dithiothréitol) ou le β-mercaptoéthanol pour maintenir les ponts disulfure dans un état réduit et prévenir la formation incorrecte de ponts disulfure
• Agents chélatants : Utilisez l'EDTA pour chélater les ions métalliques divalents qui peuvent favoriser l'agrégation ou activer les protéases

Inhibiteurs de protéases

• Utilisez un cocktail d'inhibiteurs de protéases (par exemple, PMSF, leupeptine, aprotinine) pour prévenir la dégradation protéolytique qui peut entraîner l'agrégation

Contrôle de la température

• Effectuez les étapes de purification à 4°C pour réduire l'énergie cinétique et la propension à l'agrégation des protéines. Utilisez des tampons refroidis et conservez les échantillons sur glace

Manipulation douce

• Évitez le mélange vigoureux ou le vortexage. Utilisez une pipette douce ou un brassage lent pour éviter la dénaturation mécanique. Minimisez l'exposition aux interfaces air-liquide en évitant une mousse excessive et en utilisant des tubes à faible liaison

Concentration optimale des protéines

• Maintenez les concentrations de protéines à des niveaux optimaux pour minimiser l'agrégation. Des concentrations élevées peuvent favoriser les interactions intermoléculaires

Agents stabilisants

• Polyols : Les composés comme le PEG (polyéthylène glycol) peuvent augmenter la solubilité et prévenir l'agrégation
• Acides aminés : L'arginine (0.1-0.5 M) peut stabiliser les protéines et prévenir l'agrégation

Conditions de chromatographie

• Utilisez des conditions d'élution douces (par exemple, élution par gradient progressif) pour éviter les changements brusques de composition du tampon. Évitez d'utiliser des concentrations élevées d'imidazole ou d'autres agents d'élution qui peuvent déstabiliser les protéines

Stockage approprié

• Conservez les protéines purifiées en petits aliquots pour éviter les cycles de congélation-décongélation répétés
• Utilisez des cryoprotecteurs comme 10-50% de glycérol ou de saccharose pour protéger les protéines pendant la congélation

Utilisation de chaperons moléculaires

• Co-exprimez des chaperons moléculaires pendant l'expression des protéines recombinantes pour aider au bon repliement et prévenir l'agrégation