Récolte et clarification de vecteurs lentiviraux à l'échelle du laboratoire avec les systèmes de filtration Sartoclear Dynamics Lab
Introduction
Avec l'avènement de la thérapie génique et des cellules modifiées par génie génétique, les virus sont devenus des outils essentiels en médecine. La thérapie génique a un potentiel thérapeutique significatif pour le traitement de nombreuses maladies héréditaires et acquises1, avec trois mille essais cliniques utilisant des vecteurs viraux actuellement en cours, dont environ 10 % sont menés avec des vecteurs lentiviraux2. Plus de deux mille produits uniques de cellules modifiées par génie génétique sont actuellement en développement, et quatre thérapies CAR-T ont déjà été approuvées pour traiter des indications en oncologie. La perspective prometteuse des essais cliniques en cours sur la thérapie génique et les cellules modifiées par génie génétique3,4 signifie qu'il y a une forte demande pour des méthodes évolutives et rentables de production et de purification des vecteurs viraux5.
Les vecteurs lentiviraux (LV) sont généralement produits par transfection transitoire de cellules HEK293T avec plusieurs plasmides vectoriels6,7. Le virus est libéré dans le surnageant ; par conséquent, les cellules doivent être éliminées du bouillon de culture cellulaire. L'un des défis de la recherche CAR-T est l'absence d'une méthode établie pour la clarification des LV qui soit considérée comme la norme de référence. Le but du processus de clarification est d'éliminer les principaux contaminants et de réduire la turbidité de la solution, tout en maintenant l'activité virale. La clarification à l'échelle de laboratoire est généralement effectuée par centrifugation du bouillon de fermentation et complétée par une microfiltration ultérieure du surnageant1,8,9. Simplifier la récolte et la clarification en utilisant uniquement une filtration sur membrane en une seule étape, ce qui peut être réalisé grâce à l'utilisation d'adjuvants de filtration, améliorerait l'efficacité de la purification des LV et la transduction des cellules T.
Pour simplifier les flux de travail de la recherche CAR-T, la solution de criblage de cellules T de Sartorius offre une méthode semi-automatisée multiplexée pour la découverte de nouvelles cibles et le développement de constructions CAR efficaces (Figure 1). En particulier, la série de produits de filtration Sartoclear Dynamics Lab utilisée pour la clarification du bouillon de culture cellulaire a été développée pour faciliter un flux de travail rapide et efficace de récolte des vecteurs viraux et est basée sur le principe de la filtration dynamique par alimentation de corps. L'adjuvant de filtration à base de terre de diatomées (DE) se compose de restes squelettiques fusionnés de diatomées avec une structure hautement poreuse10. Après le processus en amont, le bouillon de culture est d'abord mélangé avec un adjuvant de filtration, puis appliqué sur une membrane filtrante. La DE forme un gâteau poreux presque incompressible, et sa haute porosité permet au liquide de circuler autour des particules, empêchant ainsi le colmatage du filtre11. L'utilisation d'adjuvants de filtration élimine l'étape de centrifugation et réduit le temps de traitement.
Matériaux et méthodes
Le vecteur lentiviral a été exprimé par transfection transitoire de cellules HEK293T/17 SF, cultivées en suspension à l'aide du bioréacteur à usage unique UniVessel de 2 L (Sartorius), avec quatre plasmides codant pour les gènes lentiviraux essentiels, comme décrit en détail par Labisch et al12.
La clarification de 50 ml d'échantillons de bouillon de culture LV a été réalisée à l'aide de la version Sartoclear Dynamics Lab V50 0,45 μm polyéthersulfone (PES) (Sartorius). Le kit Sartoclear Dynamics Lab V50 contient des unités de filtration sous vide Sartolab RF50, qui se composent d'un entonnoir, d'un tube conique de 50 ml et d'un connecteur de tube pour la connexion au vide. Le kit est fourni avec un choix de quantités standard de 1 g de DE (Sartorius, SDLV-0050-01F0-2) ou 2 g de DE (Sartorius, SDLV-0050-02F0-2) pour la filtration de jusqu'à 50 ml. Des concentrations de DE allant de 5 g/L à 40 g/L de bouillon de culture cellulaire ont été testées. La DE a été ajoutée à 50 ml de bouillon de culture cellulaire et mélangée pour obtenir une suspension homogène, puis immédiatement passée à travers les filtres. De plus, la clarification de 50 ml de bouillon de culture cellulaire a été réalisée sans DE selon une méthode en deux étapes consistant en une centrifugation de 5 minutes à 800 x g et une filtration subséquente à travers un Sartolab RF50 avec une membrane PES de 0,45 μm (Sartorius, 180F01---------2). Pour la détermination de la capacité du filtre, la clarification a été réalisée jusqu'à ce que le filtre soit obstrué, et le volume du filtrat a été déterminé. La filtration sous vide a été réalisée avec le Sartolab MultiStation (Sartorius, SDLC01), un support spécialement conçu pour contenir une à six unités de filtration sous vide Sartolab RF50, permettant la filtration simultanée de jusqu'à six échantillons.
Une approche de conception d'expériences (DOE) a été réalisée pour optimiser les conditions de clarification. La concentration de DE a été variée entre 5 g/L, 12,5 g/L et 20 g/L et le temps de contact de la DE entre 0 min, 10 min et 20 min. Les expériences ont été planifiées comme un plan factoriel complet avec quatre points centraux et évaluées à l'aide du logiciel MODDE™ (Sartorius). Les paramètres analytiques utilisés pour déterminer la performance de clarification étaient les suivants : mesure de la turbidité à l'aide d'un turbidimètre Orion™ AQUAfast AQ3010 (Thermo Fisher Scientific) ; concentration totale d'ADN double brin (Quant-iT™ PicoGreen™ Assay, Thermo Fisher Scientific) ; et concentration totale de protéines (kit de dosage de protéines Pierce™ Coomassie Bradford, Thermo Fisher Scientific) avant (matériau centrifugé) et après filtration. De plus, le titre en particules LV a été déterminé en effectuant un p24-ELISA (QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit, Cell Biolabs). Le titre en particules lentivirales infectieuses a été mesuré par transduction de cellules HEK293T adhérentes avec des échantillons de virus et mesure de l'expression du transgène (construct CD19-CAR) par cytométrie en flux avec le iQue Screener PLUS (Sartorius), comme décrit précédemment12.
Résultats et discussion
Évaluation de l'impact de la concentration de DE et du temps de contact de DE sur la turbidité, le titre infectieux et le temps de filtration dans une étude DOE utilisant MODDE
Pour étudier l'effet de la DE sur la clarification des LV, les facteurs de concentration de DE et de temps de contact avec la DE ont été sélectionnés pour une approche DOE afin d'évaluer l'influence de ces paramètres sur la turbidité, le titre infectieux et le temps de filtration. La densité cellulaire totale du bouillon de culture cellulaire utilisé pour les cycles de filtration du DOE était de 3,7 x 106 cellules/mL avec une turbidité de 382 NTU.
La figure 2 montre que les réponses comprenant le titre infectieux et le temps de filtration ne sont affectées que par le facteur de concentration de DE. À mesure que la concentration de DE augmente, le titre infectieux diminue linéairement. Pour le temps de filtration, un terme quadratique pour la concentration de DE existe, entraînant une réduction du temps de filtration à mesure que la concentration de DE dans la plage de test définie augmente. La turbidité a été réduite linéairement à mesure que le temps de contact de l'échantillon avec la DE était prolongé. De plus, avec l'augmentation de la concentration de DE, la turbidité a diminué, ce dernier étant le facteur ayant le plus grand effet.
Évaluation de l'impact du Sartoclear Dynamics Lab V50 sur le temps de traitement
La manipulation du kit Sartoclear Dynamics Lab V50 avec différentes concentrations de DE a été comparée à celle de la microfiltration du surnageant centrifugé en utilisant le Sartolab RF50 (méthode standard en deux étapes). Lors de la récolte de la culture cellulaire, la densité cellulaire pour les expériences de manipulation était de 1,11 x 106 cellules/ml et la turbidité était de 141 NTU. Le temps de traitement total a été décomposé en temps de préparation (c'est-à-dire mesure des volumes de culture, élimination du surnageant après centrifugation, pesée de la DE et ajout de la DE à la suspension cellulaire), temps de centrifugation et temps de filtration.
Lors de la clarification du surnageant centrifugé, le premier filtre Sartolab RF50 s'est obstrué après environ 25 ml. Par conséquent, un deuxième filtre Sartolab RF50 était nécessaire, de sorte que la solution non filtrée restante devait être transférée vers un deuxième filtre, ce qui rendait la manipulation laborieuse et compliquée. L'utilisation du Sartoclear Dynamics Lab V50 a permis de réduire le temps de préparation total en éliminant la nécessité d'une étape de centrifugation (Figure 3A). L'utilisation du Sartoclear Dynamics Lab V50 a réduit le temps de manipulation de 3,8 fois par rapport à la méthode standard. Le temps de filtration dépendait de la concentration de DE ; il était de 25 s pour 5 g/L et descendait à 13 s pour 60 g/L (Figure 3B).
Évaluation de l'impact du Sartoclear Dynamics Lab V50 sur la turbidité et la capacité du filtre
La clarification a été effectuée soit avec le Sartoclear Dynamics Lab V50 et 5 g/L de DE, soit avec la méthode conventionnelle en deux étapes Sartolab RF50 impliquant la centrifugation du bouillon de culture cellulaire et la filtration subséquente. Le bouillon de culture cellulaire contenant le lentivirus utilisé pour la détermination de la capacité du filtre avait une densité cellulaire totale de 3,7 x 106 cellules/mL et une turbidité de 398 NTU au moment de la récolte.
Selon la figure 4A, la méthode de clarification en deux étapes combinant centrifugation et filtration (méthode standard) entraîne une turbidité significativement plus élevée de 43 NTU (réduction de 89 %), tandis que le Sartoclear Dynamics Lab V50 réduit la turbidité de 95 % jusqu'à 21 NTU. Les capacités de filtration ont été déterminées en utilisant une concentration minimale de DE de 5 g/L avec Sartoclear Dynamics Lab V50 pour la clarification. La filtration a été poursuivie jusqu'à ce que le filtre soit obstrué. La réalisation de la méthode conventionnelle à l'échelle du laboratoire de centrifugation pour l'élimination des cellules et la clarification du surnageant a entraîné une obstruction rapide du filtre juste après 33 ml. L'utilisation de 5 g/L de DE comme adjuvant de filtration a considérablement augmenté le volume de filtration maximal, permettant de dépasser plus de deux fois le volume maximum filtrable du dispositif de filtration de 50 ml utilisé. Les capacités de filtration ont augmenté de manière significative lorsqu'on utilisait 5 g/L de DE (figure 4B). En revanche, les capacités de filtration étaient faibles lorsque la clarification conventionnelle était réalisée par centrifugation et filtration subséquente (15 L/m²). Lorsque 5 g/L de DE était utilisé, les capacités de filtration augmentaient à environ 63 L/m². Après clarification avec DE, le titre infectieux de LV s'est avéré être typiquement de 75 % ou plus par rapport au matériau centrifugé.
Évaluation de l'impact du Sartoclear Dynamics Lab V50 sur l'élimination des impuretés
Dans une expérience distincte, le potentiel du Sartoclear Dynamics Lab V50 pour éliminer les impuretés liées au processus a été analysé par quantification de l'élimination des protéines totales et de l'ADN double brin (figure 5).
Une concentration de DE allant jusqu'à 10 g/L a augmenté l'élimination des protéines et de l'ADN double brin, mais des concentrations de DE plus élevées entre 10 g/L et 40 g/L n'ont pas entraîné d'amélioration supplémentaire de l'élimination des impuretés. En revanche, l'utilisation du Sartoclear Dynamics Lab V50 a entraîné une élimination significativement plus élevée des impuretés par rapport à la méthode standard en deux étapes de centrifugation et de filtration.
Conclusion
Les systèmes de filtration Sartoclear Dynamics Lab permettent la clarification des cultures cellulaires de mammifères contenant des LV sans avoir besoin de centrifugation. Comparé à la méthode standard, le Sartoclear Dynamics Lab V50 a permis une meilleure réduction de la turbidité, une plus grande élimination des contaminants et une capacité membranaire plus élevée. Cela souligne l'adéquation des systèmes de filtration Sartoclear Dynamics™ Lab pour la récolte et la clarification des vecteurs lentiviraux. La concentration de DE doit cependant être ajustée afin de récupérer des rendements élevés de LV et d'éviter les pertes de rendement dues à une quantité de DE inappropriée. Le kit Sartoclear Dynamics Lab V50 avec DE permet au technicien de laboratoire d'effectuer une filtration clarifiante en une seule étape qui non seulement facilite une manipulation plus rapide et plus sûre, mais réduit également la quantité de matériaux de laboratoire utilisés. Le kit permet de sélectionner une quantité optimisée de DE qui augmente considérablement la capacité du filtre, assurant ainsi un processus de clarification du lentivirus efficace et robuste dans les thérapies géniques et les thérapies à base de cellules modifiées par génie génétique.
Références
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12 Labisch, J. J., Bollmann, F., Wolff, M. W., and Pflanz, K. 2021. A new simplified clarification approach for lentiviral vectors using diatomaceous earth improves throughput and safe handling. Journal of biotechnology, 326, 11–20.
Abbréviations
CAR - Récepteur antigénique chimérique
(ds)DNA - Acide désoxyribonucléique (double brin)
DE - Terre de diatomées
DOE - Conception d'expérience
HEK - Cellules rénales embryonnaires humaines
LV - Vecteur lentiviral
PES - Polyéthersulfone
TU - Unités transductrices
VP - Particules virales
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