Recherche sur les virus hautement pathogènes à l'aide de pseudotypes de virus
Introduction
Les nouveaux virus, appelés virus émergents, représentent une menace pour la santé humaine d'une ampleur à ne pas sous-estimer. Ces virus ont acquis la capacité d'infecter les humains soit à la suite d'une transmission interespèces, soit en raison de modifications naturelles du génome viral1. Les infections causées par des virus émergents entraînent souvent des maladies graves voire la mort, car le système immunitaire humain peut ne pas être capable de combattre un virus inconnu, en particulier d'origine zoonotique (voir la littérature pour plus de lecture2). Divers facteurs favorisent l'apparition et la propagation des virus émergents3. Ceux-ci incluent des facteurs écologiques, tels que la déforestation pour gagner de nouvelles terres pour le développement, ainsi que notre mode de vie impliquant la mobilité globale, ainsi que le commerce international. Ainsi, la perte d'habitat augmente la probabilité que les gens, les animaux de compagnie et les animaux de ferme entrent en contact avec des espèces sauvages habitant à l'origine des zones isolées et donc non rencontrées auparavant en tant qu'hôtes naturels de virus émergents. De plus, les circonstances environnantes d'une société mondialisée impliquant des voyages accrus permettent également la dissémination de virus pathogènes à travers le monde, même avant l'apparition des symptômes cliniques.
Au cours des 100 dernières années, de multiples introductions de virus émergents dans la population humaine ont eu lieu, ce qui a conduit à des épidémies locales ou à des flambées mondiales (pandémies; voir Tableau 1). En particulier, le virus Ebola a récemment suscité des inquiétudes à travers le monde, car l'épidémie de virus Ebola en Afrique de l'Ouest, qui a fait plus de 11 000 morts, a démontré de manière dévastatrice le danger posé par les virus émergents4. La recherche impliquant des virus émergents est souvent limitée aux laboratoires de haute sécurité de niveaux de biosécurité (BSL) 3 et 4 (voir Tableau 1). Travailler dans des laboratoires BSL-4 est très laborieux, coûteux et autorisé uniquement à quelques endroits, de sorte que les progrès scientifiques rapides dans la caractérisation des agents pathogènes viraux et le développement de médicaments antiviraux sont difficiles à réaliser.
Compte tenu de cette situation, les pseudotypes viraux offrent une option attrayante pour étudier l'entrée des virus hautement pathogènes dans les cellules de manière sûre et efficace. Cela est possible car ce n'est pas l'ensemble du pathogène qui est analysé, mais seulement ses composants qui médiatisent l'entrée dans les cellules hôtes, les protéines de l'enveloppe. Celles-ci représentent la clé de l'entrée du virus dans les cellules. Dans le cas des pseudotypes viraux, les protéines de l'enveloppe des virus hautement pathogènes sont incorporées dans un virus porteur (pseudotypage), qui ne peut pas se répliquer de manière autonome, c'est-à-dire qu'ils sont déficients en réplication. Les systèmes couramment utilisés pour le pseudotypage sont basés sur les rhabdovirus (par exemple, le virus de la stomatite vésiculaire, VSV; Fig. 1) et les rétrovirus.
L'objectif de cette étude était de vérifier si l'entrée médiée par les protéines de l'enveloppe des pseudotypes viraux reflète l'entrée des virus intacts dans les cellules hôtes. De plus, cette investigation visait à déterminer quelle influence le niveau de pureté des réactifs utilisés, dans ce cas l'eau de laboratoire, a sur la production de pseudotypes viraux.
Matériels et Méthodes
Culture cellulaire, plasmides d'expression et transfection : Les cellules HEK-293T, MDCKII et Vero E6 ont été incubées dans du milieu de culture Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FCS) et 1% de solution de pénicilline/streptomycine à 37°C et 5% de CO₂. Pour le passage et le semis, les cellules ont été lavées avec du tampon phosphate salin (PBS) et détachées en les incubant avec de la trypsine | EDTA.
Pour produire des pseudotypes VSV, des plasmides des protéines d'enveloppe virale suivantes ont été utilisés comme vecteurs d'expression : glycoprotéine VSV (VSV G), glycoprotéine du virus Ebola (EBOV GP), glycoprotéine de spicule du coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV S), hémagglutinine (HA) et neuraminidase (NA) du virus de la grippe A responsable de la pandémie de « grippe espagnole », H1N1 (1918). De plus, un plasmide d'expression pour la dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) a été employé. Un plasmide d'expression vide a été utilisé comme contrôle. Les cellules HEK-293T ont été transfectées en utilisant la précipitation calcium | phosphate, où tous les tampons et solutions ont été préparés en utilisant soit de l'eau déminéralisée soit de l'eau ultrapure Sartorius Arium Pro VF.
Production d'Eau Ultrapure
L'eau ultrapure Arium Pro VF utilisée a été produite comme décrit par Nitzki et Herbig (2013)5. Cette eau a une teneur en COT (carbone organique total, c'est-à-dire carbone lié organiquement) jusqu'à < 2 ppb et une conductivité de 0,055 μS/cm (correspondant à une résistivité de 18,2 MΩ × cm), compensée à 25°C.
Production de Pseudotypes VSV
Pour la génération de pseudotypes VSV, un vecteur VSV déficient en réplication a été employé, dans lequel l'information génomique pour la glycoprotéine VSV, VSV G, a été remplacée par deux gènes rapporteurs, c'est-à-dire des cadres de lecture ouverts (ORFs) codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) et la luciférase de luciole (fLUC). Pour propager ce virus (VSV*ΔG-fLUC), le VSV G doit être fourni en trans (par exemple, par transfection d'un plasmide d'expression). Les pseudotypes VSV ont été produits comme décrit dans Hoffmann et al. (2016)6.
Prétraitement des Cellules Cibles Avec de la Sialidase ou des Inhibiteurs :
Les cellules MDCKII ont été traitées avec 200 mU de sialidase recombinante pour enlever les acides sialiques terminaux des glycoprotéines et glycolipides de la membrane plasmique. Pour tester si l'entrée médiée par les protéines d'enveloppe des pseudotypes VSV dans les cellules dépend d'un pH acide et de l'activité des protéases cystéines cellulaires, les cellules Vero E6 ont été incubées avec 50 nM de bafilomycine A1 ou 50 μM d'E-64d. Les produits chimiques utilisés ont été dilués dans le milieu de culture cellulaire; l'incubation a été réalisée pendant 2 heures à 37°C et 5% de CO₂. Les cellules non traitées ont servi de contrôles.
Analyse de l'Entrée des Protéines d'Enveloppe dans les Cellules Hôtes :
Les cellules cibles ont été incubées avec des pseudotypes VSV pendant 1 heure avant d'être lavées avec du PBS et incubées avec du milieu de culture cellulaire pendant 16-20 heures. Ensuite, les cellules ont été lysées en utilisant un tampon de lyse pour luciférase, et l'activité luciférase dans les lysats cellulaires a été mesurée dans un chimioluminomètre en utilisant des kits d'essai disponibles dans le commerce pour évaluer l'efficacité de la transduction (c'est-à-dire l'entrée des pseudotypes dans les cellules hôtes) médiée par les protéines d'enveloppe.
Résultats
Il est connu que le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV, anciennement appelé coronavirus humain, EMC = hCoV-EMC), se lie à la surface cellulaire par l'interaction entre la glycoprotéine de spicule virale (S) et la protéine membranaire cellulaire dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), permettant ainsi l'entrée dans la cellule7. Pour confirmer si cela s'applique également dans le contexte des pseudotypes VSV, les cellules cibles ont été transfectées avec un vecteur d'expression pour DPP4 ou un plasmide d'expression vide (sans récepteur). Comme prévu, l'expression dirigée de DPP4 a conduit à une augmentation significative de l'entrée des pseudotypes VSV dans les cellules hôtes si les pseudotypes avaient le MERS-CoV S intégré dans leur enveloppe (voir Fig. 2A).
Les virus de la grippe A, agents responsables de la grippe, nécessitent des structures de sucres terminaux, appelés acides sialiques, qui se produisent comme des modifications naturelles sur les glycoprotéines et glycolipides membranaires cellulaires, en tant que récepteurs pour médiatiser l'entrée dans les cellules cibles (voir la littérature pour plus de lecture8). Pour étudier si l'incorporation des protéines d'enveloppe virales de la grippe A dans les pseudotypes VSV entraîne également une entrée cellulaire dépendante des acides sialiques, des pseudotypes VSV avec HA/NA de H1N1 (1918) ont été utilisés, et les acides sialiques ont été enzymatiquement éliminés des surfaces des cellules cibles. Comme prévu, l'élimination des acides sialiques a entraîné une diminution spectaculaire de l'entrée des pseudotypes VSV dans les cellules hôtes qui avaient HA/NA de H1N1 (1918) intégrés dans leur enveloppe (voir Fig. 2B). Cette découverte confirme que les pseudotypes viraux reflètent le mécanisme d'entrée des virus authentiques de la grippe A dans les cellules.
L'activation de la glycoprotéine du virus Ebola lors de l'entrée dans la cellule dépend du pH et nécessite l'activité des protéases cystéines
La glycoprotéine du virus Ebola (EBOV GP) est modifiée post-traductionnellement pour contenir de multiples oligosaccharides, et cette densité de glycannes est censée protéger le virus d'une détection efficace par le système immunitaire humain9. Cependant, lors de l'entrée dans la cellule hôte, une partie de l'EBOV GP portant la majorité des modifications sucrées doit être retirée10. Cette activation fonctionnelle est médiée par les protéases cystéines cellulaires11 qui sont présentes dans les vésicules endosomales et ne sont actives qu'à un pH endosomal bas.
Dans ce qui suit, nous avons investigué si l'entrée médiée par l'EBOV GP des pseudotypes VSV dépend également de l'activité des protéases cystéines cellulaires et d'un pH bas. À cette fin, des pseudotypes VSV avec l'EBOV GP intégré dans leur enveloppe ont été produits et ensuite utilisés pour inoculer des cellules cibles qui avaient été préalablement incubées avec de la bafilomycine A1 (empêche l'acidification dans les endosomes en bloquant la pompe à protons) ou un inhibiteur de protéase cystéine (E-64d). Cela a montré que l'entrée cellulaire médiée par l'EBOV GP dans le contexte des pseudotypes VSV dépend également d'un environnement acide (voir Fig. 3A) et de l'activité des protéases cystéines (voir Fig. 3B). De plus, nous avons également pu démontrer que le traitement avec E-64d bloque spécifiquement l'entrée cellulaire dirigée par l'EBOV GP, car l'entrée des pseudotypes médiée par VSV-G est indépendante des protéases cystéines, bien qu'elle dépende du pH endosomal bas.
Le niveau de pureté de l'eau de laboratoire utilisée influence la qualité des pseudotypes VSV
Après avoir montré dans les essais précédents que les pseudotypes VSV sont des modèles appropriés pour étudier l'entrée des virus hautement pathogènes dans les cellules hôtes, la question suivante à clarifier était l'influence particulière que le niveau de pureté de l'eau de laboratoire utilisée a sur la qualité des pseudotypes VSV. Lors de la production des pseudotypes VSV, divers tampons et solutions sont utilisés, tous préparés avec de l'eau. Cependant, il faut noter que n'importe quel type d'eau ne suffit pas pour la préparation de ces réactifs. Plutôt, il faut faire le bon choix de niveau de pureté pour une utilisation en laboratoire.
Pour étudier si l'utilisation d'eau ultrapure produit des pseudotypes VSV de meilleure qualité, deux lots de pseudotypes VSV ont été générés dans une expérience parallèle : Un lot a été préparé en utilisant de l'eau déminéralisée provenant d'une source centrale d'approvisionnement en eau de laboratoire (conductivité de 3,7 – 4,1 μS/cm à 19°C) comme solvant de base pour toutes les solutions et tampons, tandis qu'un autre lot utilisant des solutions et tampons à base d'eau ultrapure Arium Pro VF (conductivité de 0,055 μS/cm compensée à 25°C) a été généré. L'EBOV GP et le MERS-CoV S en tant que protéines d'enveloppe ont été examinés. Suite à la production parallèle de pseudotypes VSV en maintenant des conditions d'incubation identiques, les cellules cibles ont été inoculées et l'entrée des pseudotypes VSV médiée par les protéines d'enveloppe a été quantifiée.
Cette configuration expérimentale a démontré que l'entrée dans les cellules hôtes (en tant que paramètre pour le degré de qualité) des pseudotypes VSV produits en utilisant de l'eau ultrapure Arium Pro VF comme solvant de base pour tous les tampons et solutions était significativement plus élevée par rapport à celle des pseudotypes pour lesquels de l'eau déminéralisée avait été utilisée dans leur production (Fig. 4).
Discussion
Au cours de cette étude, des pseudotypes viraux ont été produits sur la base d'un virus de la stomatite vésiculaire (VSV) déficient en réplication, et les protéines d'enveloppe de divers virus hautement pathogènes ont été étudiées. Nous avons montré que l'entrée dans les cellules hôtes reposait sur des molécules réceptrices et des processus biochimiques identiques à ceux décrits pour les virus authentiques. De plus, nous avons démontré que l'utilisation d'eau ultrapure pour la production de pseudotypes VSV a permis une optimisation de ce processus. Les futures investigations devraient être conçues pour clarifier sur quoi repose cette observation : est-ce dû à une quantité accrue de pseudotypes VSV produits, une entrée cellulaire plus efficace ou une stabilité améliorée des pseudotypes ? Par exemple, nous pouvons spéculer que l'absence de sels, de protéinases ou de lipases lorsque de l'eau ultrapure est utilisée augmente la stabilité des pseudotypes VSV.
En conclusion, on peut affirmer que les pseudotypes viraux sont des outils importants pour étudier l'entrée des virus hautement pathogènes dans les cellules hôtes. Comme ces pseudotypes viraux ne limitent pas la recherche sur de tels virus hautement pathogènes aux laboratoires BLS-3 ou BLS-4, cela permet à un plus grand nombre d'installations scientifiques de mener de telles recherches.
En conséquence, l'entrée cellulaire des virus émergents peut être caractérisée et des procédures de détection appropriées ainsi que des stratégies antivirales (médicaments, vaccins) peuvent être développées plus rapidement. L'utilisation de pseudotypes réduit également l'intensité considérable du travail impliqué dans les laboratoires de haute sécurité nécessitant des combinaisons de protection intégrale, ainsi que les coûts considérables et les limitations entraînées par ce type de travaux en laboratoire (par exemple, pas d'accès à l'équipement qui n'est pas directement situé à l'intérieur du laboratoire de haute sécurité). De plus, par rapport aux virus authentiques hautement pathogènes, les pseudotypes viraux minimisent le risque d'infection du personnel de laboratoire suite à une exposition non intentionnelle, représentant ainsi un aspect de sécurité significatif.
L'optimisation du processus de production, par exemple, grâce à l'utilisation de réactifs hautement purs, en particulier ceux à base d'eau, peut également contribuer à améliorer la sensibilité des procédures de test ultérieures, à augmenter les quantités de production et ainsi à réduire encore les coûts de production.
Références
1 Li, W. et al. Animal origins of the severe acute respiratory syndrome coronavirus: Insight from ACE2-Sprotein interactions. Journal of Virology 2016; 80: 4211–4219.
2 Mandl, J. et al. Reservoir host immune responses to emerging zoonotic viruses. Cell 2015; 160: 20–35.
3 Morse, S. S. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerging Infectious Diseases 1995; 1: 7–15.
4 Shiwani, H. A. et al. An update on the 2014 Ebola outbreak in Western Africa. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2017; 10: 6–10.
5 Nitzki, F., Herbig, E. In situ Hybridisierung – Die Bedeutung von Reinstwasser für RNA Technologien”, GIT Labor-Fachzeitschrift 57. Jahrgang, 3; 2013 [also available in English: In Situ Hybridization: The Importance of Ultrapure Water for RNA Technologies].
6 Hoffmann, M. et al. The glycoproteins of all filovirus species use the same host factors for entry into bat and human cells but entry efficiency is species dependent. PLoS One; 2016, Vol. 11.
7 Raj, V. S. et al. Dipeptidyl peptidase 4 is a functional receptor for the emerging human coronavirus-EMC. Nature 2013; 495: 251–254.
8 De Graaf, M., Fouchier, R. A. M. Role of receptor binding specificity in influenza A virus transmission and pathogenesis. The EMBO Journal 2014; 33: 781–935.
9 Cook, J. D., Lee, J. E. The secret life of viral entry glycoproteins: Moonlighting in immune evasion. PLoS Pathogens 2013; Vol. 9.
10 White, J. M., Schornberg, K. L. A new player in the puzzle of filovirus entry. Nature Reviews Microbiology 2012; 10: 317–322.
11 Chandran, K. et al. Endosomal proteolysis of the Ebola virus glycoprotein is necessary for infection. Science 2005; 308: 1643–1645.
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