Comment réussir les applications de thérapie génique lorsque la reproductibilité expérimentale est cruciale

Il existe d’innombrables approches scientifiques et procédures techniques complexes dans un processus, et, par conséquent, un résultat expérimental peut être difficile à reproduire. Toutes les parties impliquées dans le développement et la mise à disposition de médicaments de nouvelle génération doivent s’appuyer sur des preuves robustes dérivées de données concernant leurs bénéfices, afin de soutenir la prise de décision et d’assurer la traduction des découvertes prometteuses en thérapeutiques efficaces.

Ici, nous mettons en évidence certains obstacles à la reproductibilité expérimentale liés aux équipements de laboratoire et fournissons des recommandations sur la manière de les surmonter. Atteindre le plus haut niveau d’uniformité dans les pratiques courantes de laboratoire est absolument nécessaire. Cela signifie que les scientifiques de laboratoire doivent être suffisamment formés et suivre strictement les procédures correctes pour l’utilisation et l’entretien des équipements de laboratoire. Dans les environnements de recherche académique, ces protocoles sont conçus par les responsables de laboratoire sur la base des recommandations contenues dans les manuels d’utilisation fournis par les fournisseurs d’équipements. Étant donné qu’il n’existe pas de règles spécifiques à suivre, les pratiques académiques peuvent varier considérablement. Thermo Fisher Scientific reconnaît la nécessité de fournir un soutien supplémentaire sous forme de divers matériaux complets, comprenant des notes techniques, des notes d’application et des Smart Notes, couvrant tous les aspects de l’utilisation et de l’entretien des équipements. L’objectif est de vous permettre de tirer le meilleur parti de vos équipements et d’augmenter la reproductibilité de vos données expérimentales.

Amélioration des Pratiques de Laboratoire à l’Échelle de la Recherche

Production de Plasmides

Dans un cadre académique, les plasmides codant pour des vecteurs viraux sont généralement produits dans des cellules bactériennes Escherichia coli sur des agitateurs orbitaux, tels que les Thermo Scientific™ Solaris™ Benchtop Temperature Controlled Shakers. Si l’objectif est d’obtenir des plasmides de haute qualité, en quantité et de manière reproductible, certaines caractéristiques clés doivent être prises en compte. Par exemple, il a été démontré que des vitesses d’agitation allant jusqu’à 400 tr/min produisent des rendements plus élevés et que limiter la circulation des micro-organismes, qui pourraient contaminer la culture, est important pour garantir l’intégrité du produit final. De même, les fonctionnalités permettant un nettoyage régulier et facile garantissent qu’aucune surface ne conserve de contaminants résiduels. De plus, la possibilité de visualiser et de modifier simultanément les paramètres pendant le fonctionnement de l’agitateur est bénéfique pour assurer le contrôle qualité. Une Smart Note¹ est dédiée aux considérations importantes lors de l’évaluation d’un grand agitateur orbital pour la production d’ADN plasmidique.

Les suspensions doivent être agitée à différentes vitesses et avec différentes orbites selon le type de récipient et de cellules, il est donc crucial de choisir l’agitateur orbital adapté à votre application². D’autres éléments, tels que l’installation correcte de l’agitateur, l’utilisation et les bonnes pratiques de production cellulaire, les processus de nettoyage et de désinfection, ainsi que la maintenance préventive régulière, sont également essentiels pour améliorer la reproductibilité expérimentale³. Thermo Fisher Scientific prend toujours de l’avance et a investi beaucoup de temps et de ressources pour optimiser les protocoles les plus nécessaires (par exemple, la production d’ADN plasmidique dans E. coli⁴), vous n’avez donc pas besoin de le faire. Vous pouvez augmenter l’efficacité et en même temps la reproductibilité expérimentale en testant et, éventuellement, en mettant en œuvre ces protocoles dans votre laboratoire.

D’autres activités critiques dans la préparation de l’ADN plasmidique sont la formation de culot de cellules bactériennes et l’extraction et purification du plasmide. Dans un cadre académique, la centrifugation reste le moyen le plus populaire et rentable d’exécuter ces étapes. Par exemple, l’ADN plasmidique peut être isolé dans un gradient de chlorure de césium, mais cette méthode nécessite une ultracentrifugeuse telle que le Thermo Scientific™ Sorvall™ WX+ et utilise du bromure d’éthidium. Alternativement, des kits à gravité ou à colonne spin peuvent purifier efficacement l’ADN plasmidique dans des centrifugeuses superspeed et microcentrifugeuses. Pour augmenter la reproductibilité de votre protocole, un Thermo Scientific™ Sorvall™ LYNX 6000 Superspeed Centrifuge et des Thermo Scientific™ Fiberlite Carbon Fiber Rotors peuvent être utilisés en combinaison avec des kits commerciaux de préparation d’ADN pour obtenir de l’ADN plasmidique de haute qualité à grande échelle (environ 1 mg). Une méthode moins coûteuse est également disponible sans kit. Les deux protocoles ont été optimisés et les recommandations sont facilement accessibles sous forme de note d’application⁵.

De plus, Thermo Fisher Scientific fournit des manuels utilisateurs complets pour tous ses modèles de centrifugeuses, comme le LYNX⁶, incluant des recommandations pour la désinfection, la décontamination, l’autoclavage et la maintenance, facilement traduisibles en procédures opérationnelles étape par étape. Cela permet non seulement d’augmenter la durée de vie de la centrifugeuse, mais aussi d’améliorer le taux de réussite et la reproductibilité des procédures d’extraction de plasmides. En outre, si vous prévoyez de passer à l’avenir d’opérations de recherche à un environnement réglementé GLP/GMP, le Thermo Scientific™ Centri-Log™ Plus Data Management Software⁷ peut être intégré aux centrifugeuses Sorvall™ LYNX afin de permettre une collecte précise des données et une traçabilité conforme à la réglementation 21 CFR Part 11 sur l’enregistrement électronique des données.

Production de Vecteurs Viraux

Développer et optimiser votre plateforme de production de lentivirus afin de créer des protocoles de transfection robustes peut devenir très complexe, surtout lorsque vos priorités sont le rendement élevé, l’évolutivité et la reproductibilité. Tous les composants, y compris les milieux de culture, les réactifs de transfection, les suppléments et les cellules, doivent fonctionner en parfaite synergie pour générer des particules lentivirales supérieures et fonctionnelles. Les applications de recherche, telles que la création de nouvelles thérapies géniques, dépendent fortement d’une croissance cellulaire de haute qualité. Un exemple illustratif est l’utilisation de cultures adhérentes ou en suspension pour les cellules de production virale HEK 293. Si les cellules ne sont pas cultivées dans des conditions optimales, à la fois les résultats expérimentaux et la reproductibilité seront affectés de manière négative et difficile à détecter.

Les attributs de qualité du produit cellulaire final, c’est-à-dire les particules virales, peuvent varier considérablement en fonction des conditions de culture maintenues dans l’incubateur à CO2. En fait, le rendement reproductible de la culture peut être fortement influencé par la mise en œuvre de différentes fonctionnalités et technologies dans la conception de l’incubateur à CO2. Comme les cellules réagissent à des signaux différents ou changeants, il est crucial que les conditions dans la chambre de culture soient uniformes de haut en bas et de côté à côté, de sorte que toutes les cellules expérimentent les mêmes conditions. Il est encore plus important que l’incubateur retrouve rapidement les conditions souhaitées après l’ouverture de la porte, afin que les cellules passent le maximum de temps dans leurs paramètres idéaux, ce qui accélère le temps de doublement et contribue à garantir la qualité. Les conditions idéales pour la santé et la croissance cellulaires ne se limitent pas à la température, car le niveau de CO2, le niveau d’oxygène et l’humidité relative (HR) sont également importants, car tous influencent la santé cellulaire. Les incubateurs qui assurent uniformité et récupération rapide, comme les Thermo Scientific™ Heracell™ VIOS CO₂ et Forma™ Steri-Cycle™ CO₂ aideront à améliorer la reproductibilité d’un lot à l’autre. De plus, Thermo Fisher Scientific fournit des informations sur les meilleures pratiques pour l’entretien et le soin appropriés de votre incubateur de culture cellulaire, y compris des conseils sur l’installation et le positionnement dans le laboratoire, la réduction des contaminations, les procédures de désinfection et les recommandations sur le type d’eau à utiliser. Tout cela afin de garantir des résultats expérimentaux de qualité qui favoriseront vos découvertes.⁸,⁹

Si vous cultivez vos cellules de production lentivirale HEK 293 en suspension, vous pouvez bénéficier de l’utilisation d’un agitateur orbital résistant au CO2 et à faible encombrement. Idéal pour une utilisation dans un incubateur à CO2, ces agitateurs ont des composants mécaniques spécialement traités pour résister à jusqu’à 20 % de CO2 et 95 % d’humidité. En comparaison, la plupart des agitateurs orbitaux à air libre ne sont pas conçus pour résister aux conditions acides d’une chambre à CO2 et doivent être remplacés régulièrement. Les Thermo Scientific™ CO₂-Resistant Orbital Shakers sont également conçus pour dissiper un minimum de chaleur, garantissant que les conditions dans la chambre de l’incubateur à CO2 ne sont pas affectées. Le choix correct de l’agitateur orbital pour votre application peut prolonger sa durée de vie et garantir que les conditions de croissance optimales et la reproductibilité des résultats de culture sont maintenues.

Conclusions

Il existe de nombreux exemples d’équipements de laboratoire présents dans la recherche sur la thérapie génique auxquels on ne pense peut-être pas, mais qui ont un potentiel significatif pour influencer la reproductibilité de vos résultats expérimentaux. La leçon essentielle à retenir est de prêter davantage attention et de consacrer plus de temps à se familiariser avec les recommandations du fournisseur, telles qu’elles sont fournies dans les manuels d’utilisation et les différentes notes techniques. Dans les environnements de recherche expérimentale, il est courant de se concentrer principalement sur des protocoles expérimentaux spécifiques, en négligeant les recommandations concernant l’installation de l’équipement et son positionnement correct, ainsi que l’entretien préventif, la prévention de la contamination et les procédures de nettoyage et de désinfection. N’oubliez pas que même des équipements de laboratoire comme les hottes de sécurité biologique, les centrifugeuses, les incubateurs, les agitateurs, les réfrigérateurs et les congélateurs doivent être traités avec respect et beaucoup de soin. Ils doivent devenir un partenaire dans votre démarche visant à rendre vos expériences à la fois plus réussies et plus reproductibles.

Références

¹ Thermo Scientific. Smart Note: Orbital Shakers-Which Features are Important Considerations When Evaluating a Large Orbital Shaker for Production of Plasmid DNA Encoding Viral Vectors, for Applications Including CAR-T, Gene Therapy, or Other Genetic Engineering? https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LPD/Product-Information/Orbital-Shakers-DNA-Encoding-SmartNote-SNORBSHAKERDNA-EN.pdf

² Thermo Scientific. Application Note: Choosing the Right Orbital Shaker for Your Application. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D20064.pdf

³ Thermo Scientific. Application Note: Orbital Shaker Benchmarks-Best Practices for Use and Maintenance. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/Orbital-Shaker-Benchmarks-Best-Practices-App-Note-ANMAXQBEST.pdf

⁴ Thermo Scientific. Application Note: Optimization of Plasmid DNA Production in Escherichia coli Utilizing the Thermo Scientific MaxQ 8000 Incubated Stackable Shakers. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D19993~.pdf

⁵ Thermo Scientific. Application Note: DNA Preparation Using the Thermo Scientific Sorvall LYNX Superspeed Centrifuge Series. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D21231.pdf

⁶ Thermo Scientific. Instruction Manual: Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000/6000 Superspeed Centrifuge. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLED%2Fmanuals%2F50136519-h-Thermo%20Scientific%20Sorvall%20LYNX-en.pdf

⁷ Thermo Scientific. Centri-Log Plus Software: An Accurate and Reliable Data Management Solution. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLPD%2Fbrochures%2FCentriLog-Plus-Brochure-GLOBAL-FNL-FWR-1.pdf

⁸ Thermo Scientific. Technical Note: Proper Care and Maintenance for a Cell Culture Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Warranties/TNCO2CAREFEED-EN.pdf

⁹ Thermo Scientific. Smart Note: CO₂ Incubators-Smart Water for Your CO₂ Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/brochures/CO2-Incubator-Water-SmartNote-EN.pdf