Principes fondamentaux de la sécurité des bioprocédés : tests de détection des endotoxines, des mycoplasmes et de stérilité

Test d'endotoxines

Le contrôle des endotoxines est obligatoire tout au long du processus de biotransformation, à commencer par les matières premières telles que l'eau pour injection (WFI), les composants des milieux et les excipients. Les normes USP <85>, EP 2.6.14 et JP 4.01 définissent toutes le test de référence actuel, le lysat d'amibocytes de limule (LAL), qui nécessite des méthodes validées (coagulation en gel, turbidimétrie ou chromogénie) avec une sensibilité établie pour garantir des résultats inférieurs aux limites d'endotoxines spécifiées. Les lignes directrices de l'EMA recommandent une surveillance régulière en cours de fabrication afin de vérifier que les étapes de purification éliminent systématiquement les endotoxines à des niveaux acceptables. Historiquement, le test du lysat d'amibocytes de limule (LAL) a été la référence en matière de test d'endotoxines. Bien que sensible et bien établi, le test LAL présente plusieurs défis, notamment la dépendance vis-à-vis des animaux (lysat provenant de limules), les interférences des matrices de processus et la variabilité. Pour pallier ces limites, les tests du facteur C recombinant (rFC) remplacent de plus en plus le LAL dans les bioprocédés. Le rFC utilise une version recombinante de l'enzyme de coagulation du crabe fer à cheval, éliminant ainsi le besoin de lysat d'origine animale.

Les avantages du rFC sont les suivants :

• Durabilité et éthique : aucun crabe fer à cheval n'est capturé, ce qui rend le test respectueux de l'environnement.
• Robustesse de la matrice: les tests rFC sont souvent moins sensibles aux interférences provenant de milieux complexes et d'excipients, ce qui réduit la nécessité d'une préparation approfondie des échantillons.
• Cohérence et reproductibilité: la production recombinante garantit une cohérence d'un lot à l'autre et des performances fiables sur différents sites et campagnes de fabrication.

Les agences réglementaires, notamment la FDA et l'EMA, reconnaissent désormais le rFC comme une alternative acceptable au LAL, à condition que l'équivalence soit démontrée par la validation de la méthode. Dans le cadre des bioprocédés modernes, l'adoption du rFC favorise la durabilité des opérations tout en maintenant le contrôle rigoureux des endotoxines requis pour la sécurité des produits.

Test de dépistage des mycoplasmes

Les processus basés sur la culture cellulaire sont très vulnérables aux mycoplasmes, qui peuvent pénétrer via des matières premières contaminées (par exemple, sérum bovin, trypsine) ou par exposition des opérateurs/de l'environnement lors des opérations en amont. Les normes USP <63> et EP 2.6.7 exigent que les produits biologiques fabriqués à partir de cellules mammifères soient testés pour vérifier l'absence de mycoplasmes avant la libération des lots (6,7). Les tests classiques prévus par les pharmacopées comprennent des méthodes de culture en bouillon et sur gélose pendant 28 jours, associées à des tests sur des cellules indicatrices (coloration de l'ADN). Cependant, les directives de la FDA et de l'EMA autorisent les techniques validées d'amplification des acides nucléiques (NAT) comme alternatives rapides, permettant une détection plus précoce pendant le traitement en amont et réduisant le risque de contamination à grande échelle. Les meilleures pratiques en matière de biotransformation appliquent les tests de dépistage des mycoplasmes non seulement à la substance médicamenteuse finale, mais aussi aux banques de cellules maîtresses (MCB), aux banques de cellules de travail (WCB) et aux matériaux récoltés en cours de fabrication.

Test rapide de stérilité

La garantie de stérilité s'étend à l'ensemble de la chaîne de biotransformation. Les normes USP <71>, EP 2.6.1 et JP 4.06 imposent des tests de stérilité des produits pharmaceutiques finis à l'aide d'une filtration sur membrane (préférée pour les solutions claires et les grands volumes) ou d'une inoculation directe (utilisée pour les produits à petit volume ou à base d'huile), avec une période d'incubation de 14 jours (10-12). Pour les matières premières telles que l'eau pour injection (WFI) et les milieux de culture, les limites microbiologiques officielles (USP <61>, <62>) sont appliquées en amont (13,14). Dans le traitement en aval, une filtration aseptique, des contrôles en salle blanche et des filtres de stérilisation validés (0,22 μm) sont nécessaires pour garantir la stérilité. Les médicaments de thérapie innovante (ATMP) et les produits biologiques à courte durée de conservation adoptent de plus en plus des méthodes microbiologiques rapides (RMM), à condition qu'elles soient validées comme équivalentes ou supérieures aux tests de stérilité officiels (15,16).