Traitement en aval des cellules T primaires à l'aide de centrifugeuses Thermo Scientific™ General-Purpose Pro
Introduction
Le lavage et la concentration des cellules constituent l'une des principales étapes de la recherche et de la fabrication des thérapies cellulaires. Au cours de cette étape, les cultures de cellules expansées sont concentrées et lavées dans des solutions tampons appropriées afin de préparer les étapes en aval, telles que le remplissage et la formulation. La principale méthode utilisée depuis de nombreuses années est la centrifugation discontinue, bien que d'autres méthodes telles que la centrifugation à flux continu, la séparation acoustique et la filtration à flux tangentiel aient vu le jour au fil des ans.
Nous montrons ici les avantages de la centrifugation par lots, ainsi que des solutions innovantes utilisant les Thermo Scientific™ General-Purpose Pro Centrifuges qui peuvent être optimisées pour le traitement en aval des cellules T primaires. Nous partageons également quelques résultats exemplaires concernant la viabilité et la récupération des cellules T après lavage et concentration.
Caractéristiques des équipements adaptés aux applications de fabrication de thérapies cellulaires
Sécurité et contrôle total : SECURE-Spin
Les centrifugeuses sont dotées d'un système avancé de gestion des utilisateurs en mode SECURE-Spin, dans lequel les utilisateurs se voient attribuer différents rôles et privilèges afin de maintenir un contrôle sécurisé, une fonction qui contribue à la conformité à la norme FDA 21 CFR Part 11 (figure 1). Les fonctions avancées du mode SECURE-Spin vous permettent de :
- Enregistrer jusqu'à 120 personnes avec des noms d'utilisateur et des mots de passe uniques
- Assigner des privilèges et des rôles individuels à chaque utilisateur, avec des autorités différentes
- Tracer toutes les modifications apportées par les utilisateurs aux programmes ou aux paramètres grâce à une piste d'audit
Reproductibilité : La fonction d'intégrateur ACE
La fonction intégratrice Thermo Scientific™ Accumulated Centrifugal Effect™ (ACE™) est un modèle mathématique qui aide à transférer les applications et les réglages de paramètres entre les centrifugeuses en modifiant automatiquement la durée d'exécution comme substitut du temps (figure 2).
La fonction ACE peut être activée en naviguant vers "Réglages" puis "Contrôles", avant de changer le mode de point de consigne sur "Avancé". Elle a été conçue pour garantir que différents lots d'échantillons reçoivent le même effet centrifuge souhaité, indépendamment du poids de l'échantillon, de l'âge de l'équipement ou de facteurs environnementaux tels que l'altitude (figure 3). Les avantages de l'activation de la fonction pour les centrifugeuses Pro à usage général sont les suivants :
- Aide à obtenir la même force centrifuge totale accumulée quelles que soient les conditions (par exemple, la durée de fonctionnement, la charge du rotor et la charge de l'échantillon)
- Permet d'obtenir des rendements reproductibles en compensant automatiquement les variations d'accélération en ajustant la durée de fonctionnement de la centrifugeuse
- Soutient la reproductibilité vitale dans la thérapie cellulaire et génique
Pour déterminer la valeur de la fonction ACE, il est nécessaire de disposer d'un protocole de travail dans lequel la vitesse et la durée d'exécution sont connues. En mode ACE, entrez la valeur optimale de la vitesse et une valeur ACE "élevée" (la valeur la plus élevée permet de s'assurer que la course n'est pas arrêtée prématurément). Lancez un chronomètre au début du cycle de centrifugation, arrêtez la centrifugeuse lorsque le temps du chronomètre a atteint la durée de fonctionnement connue, et enregistrez la valeur ACE affichée à l'écran.
Prévention de la contamination
Thermo Scientific™ ClickSeal™ Biocontainment Lids protège les échantillons de la contamination mutuelle, permettant la centrifugation de divers échantillons au cours d'un même cycle. En cas d'événements de déversement, l'échantillon est contenu dans son godet, protégeant ainsi les échantillons des autres godets, les utilisateurs et l'environnement du laboratoire. Les principales caractéristiques des couvercles ClickSeal sont les suivantes :
- Conception ergonomique pour une ouverture et une fermeture faciles d'une seule main, que l'on soit gaucher ou droitier
- Options de scellage de bioconfinement pour une utilisation adaptée aux gants
- Utilisation simple pour tous les utilisateurs de laboratoire, avec l'élimination des bouchons à vis multitours et des clips haute pression compliqués
- Certification de confinement par l'Institut national de protection de la santé, Porton Down, Royaume-Uni
L'état de santé dans la recherche et la fabrication de thérapies cellulaires, en particulier pour les types de cellules autologues, n'est pas facilement disponible, et la rapidité est la clé du succès. Les équipements de laboratoire doivent donc être prêts à fonctionner parfaitement en cas de besoin. Le bouton "Health Status" de nos centrifugeuses permet de suivre et d'enregistrer chaque alarme, notification d'alerte et cycle de vie du rotor (figure 4). Cela permet d'éviter les temps d'arrêt, ce qui est vital pour la continuité du processus.
Gestion du rotor : SMART-Spin™
Le système de gestion avancée du rotor SMART-Spin™ maximise l'accélération, la décélération et le déséquilibre de la charge résiduelle pour chaque option de rotor et de godet. Les centrifugeuses Pro à usage général permettent en outre un réglage fin des paramètres de centrifugation avec une grande précision (incréments de 1 tr/min pour la vitesse et de 1 s pour la durée). En outre, l'accélération et la décélération en douceur permettent de maximiser l'intégrité des granulés tout en maintenant l'efficacité du processus. Dans l'exemple ci-dessous, nous avons utilisé le profil d'accélération 9 et le profil de décélération 7 pour minimiser la perte de cellules et maintenir la viabilité.
Viabilité et récupération des cellules T
Méthodes
Les cellules T primaires fournies par des donneurs sains ont été transférées dans des récipients coniques de 50ml et 500ml à une concentration de 1 x 106 cellules/ml. Le comptage des cellules a été effectué à l'aide de l'appareil Via2-Cassette™ et de l'instrument NucleoCounter™ NC-200™ (ChemoMetec ; Allerod, Danemark). Les conteneurs ont été centrifugés dans la Thermo Scientific™ Multifuge™ X4R Pro General-Purpose Centrifuge à 400 x g à température ambiante pendant 10 minutes. La viabilité et la récupération des cellules T ont été déterminées après lavage et concentration. Remarque : la concentration cellulaire de 1 x 10⁶ cellules/ml utilisée est quatre à cinq fois inférieure aux valeurs habituelles, afin de simuler un scénario catastrophe.
Résultats
Nos résultats suggèrent que les deux types de conteneurs coniques, 50ml et 500ml, ont donné des résultats équivalents dans la concentration des cellules T, avec une diminution minimale de la viabilité et des taux de récupération élevés (figure 5).
Conclusions
La centrifugation en discontinu a été le cheval de bataille de la fabrication des thérapies cellulaires pendant des décennies. Sur la base de nos résultats, nous concluons qu'il s'agit de la méthode privilégiée en raison des avantages suivants :
- Aucune limitation des types de cellules applicables
- Pas de colmatage lorsque des densités cellulaires élevées sont traitées
- Haute performance avec une faible densité de cellules
- Contrôle actif et maintien de la température du procédé
- Faible investissement en capital, avec de faibles coûts de maintenance et d'exploitation
- Développement de procédés simples
- Suffisamment flexible pour être utilisé dans de nombreuses applications de laboratoire
