- La première étape consiste à disposer d'un espace de travail propre. Un banc PCR (également appelé banc propre, hotte à flux laminaire, etc.) est un excellent point de départ. Les postes de travail PCR empêchent la contamination de fond et la contamination croisée en maintenant tous les contaminants présents dans l'air à l'écart des échantillons.
- Toutes les surfaces de la zone PCR doivent être régulièrement décontaminées pour éviter la contamination croisée, à l'aide d'une solution de décontamination de l'ADN qui détruit l'ADN.
- Disposer de plusieurs jeux de pipettes et séparer les pipettes destinées aux différentes étapes du flux de travail.
- Envisager d'inclure un contrôle de transcriptase inverse négatif (ou « contrôle d'absence d'amplification » / NAC) dans les expériences de qRT-PCR. Il s'agit généralement d'une transcription inverse simulée contenant tous les réactifs RT-PCR à l'exception de la transcriptase inverse. Si un signal est observé dans le NAC, cela signifie probablement que votre échantillon est contaminé par de l'ADN.
- Vous pouvez également utiliser un spectrophotomètre pour vous faire une idée de la concentration et de la qualité de votre ADN. Le rapport de l'absorbance à 260 et 280 nm (A260/280) doit être compris entre 1,8 et 2,0. S'il s'en écarte, vos échantillons peuvent avoir été contaminés par des sels, des solvants ou des protéines. En cas de contamination, appliquez un protocole de nettoyage, tel qu'un kit de nettoyage.
La réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) est un élément essentiel de tout laboratoire traitant des acides nucléiques, comme les laboratoires de recherche sur le cancer (voir ici nos meilleurs choix de produits pour la recherche sur le cancer) capable de produire des mesures d'une précision étonnante. Cependant, de nombreux scientifiques éprouvent encore des difficultés à produire des résultats fiables et reproductibles à chaque fois.
Voici quelques erreurs courantes qui pourraient être à l'origine de vos déboires en matière de qPCR, ainsi que nos suggestions pour les éviter.
1. Votre échantillon a été contaminé
Cela arrive. L'ADN est partout et, si vous ne prenez pas les précautions nécessaires, il se retrouvera également dans votre échantillon. En outre, d'autres contaminants tels que l'hémoglobine, l'éthanol et le phénol peuvent inhiber la PCR.
Il existe de nombreux points par lesquels la contamination peut pénétrer dans vos échantillons. Voici quelques conseils pour minimiser les risques de contamination de vos échantillons.
2. Votre échantillon s'est dégradé
L'ARN dégradé ressemble à une tache sur un gel d'agarose et ne forme pas de bandes d'ARN ribosomal reconnaissables. Mais comment cela s'est-il produit ? Il y a plusieurs éléments à prendre en compte si vous souhaitez conserver votre échantillon en bon état pour le soumettre à une PCR.
- Conservez vos échantillons correctement. On ne saurait trop insister sur l'importance d'investir dans un stockage adéquat de vos échantillons. S'ils sont sensibles à des facteurs environnementaux, vous devez être certain à 100 % que ces facteurs sont sous contrôle. Le stockage des échantillons comprend tout, de l'équipement, aux flacons, en passant par le tampon, et vous avez besoin d'un système pour contrôler si vos échantillons sont menacés par un changement d'environnement. En particulier si votre échantillon est rare, difficile à obtenir ou coûteux, il n'est pas logique de ne pas investir dans son entretien et d'utiliser un tampon de préservation de l'ARN. Nous n'insisterons jamais assez sur ce point. Pour obtenir les meilleurs résultats, vos échantillons doivent être aussi frais que possible ; évitez donc de les soumettre à de nombreux cycles de décongélation/congélation.
- Votre échantillon peut avoir été contaminé par des enzymes nucléases. Veillez toujours à nettoyer correctement votre espace de travail à l'aide d'une solution d'inactivation de la RNase. Vous pouvez également ajouter un réactif tel que RNAsecure™ à votre solution pour éliminer le contaminant RNase dans votre échantillon.
- La plupart des kits PCR commerciaux contiennent un inhibiteur de RNase, et ce pour de bonnes raisons. Si vous utilisez encore un kit qui n'en contient pas, il est peut-être temps de passer à un kit qui en contient.
- Enfin, il est important de n'utiliser que de l'eau exempte de nucléase. Vous pouvez l'obtenir prête à l'emploi ou la fabriquer vous-même au laboratoire.
3. Manque de conception des amorces et des sondes
- Pour obtenir les meilleurs résultats, il est fortement recommandé d'utiliser un logiciel de conception d'amorces. NCBI propose une plateforme gratuite de conception d'amorces que vous pouvez consulter.
- Lors de la conception d'amplicons dans des cibles eucaryotes, choisissez des amorces PCR qui couvrent au moins une jonction exon-exon dans l'ARNm cible afin d'éviter que l'amplification de la cible ne contamine l'ADN génomique.
- Il convient également de garder à l'esprit, lors de la conception des amorces, les structures primaires et secondaires qui peuvent avoir un impact sur la réaction, et un logiciel peut vous aider à contourner ce problème.
- L'idéal est d'éviter les régions présentant de nombreuses répétitions de paires de bases, mais ce n'est évidemment pas toujours possible.
- Les régions composées de plus de 60 % de GC peuvent être particulièrement délicates, car elles sont non seulement très thermostables, mais leur « pliabilité » signifie qu'elles ont tendance à former des structures secondaires, comme des épingles à cheveux. Heureusement, il existe des additifs disponibles dans le commerce qui peuvent vous aider à résoudre ce problème, comme le mélange maître ou la polymérase appropriés.
4. Ne pas utiliser les master mix
Ce qui nous amène au point suivant.
Les qRT sont des outils extrêmement sensibles et efficaces pour l'amplification de l'ARN, ce qui est très bien, mais qui amplifie aussi les erreurs. Bien entendu, la variabilité entre les puits et les échantillons doit être réduite au minimum et la reproductibilité doit être maximale. C'est là que les master mix entrent en jeu. Pour réduire davantage la variation d'un puits à l'autre, un colorant de référence tel que le ROX peut être ajouté au mélange maître.
5. Erreur de l'utilisateur
Personne n'est parfait et, surtout lorsqu'il s'agit d'un travail fastidieux et souvent répétitif, des erreurs peuvent se produire. Quelques erreurs courantes peuvent se produire, en particulier lorsque vous êtes fatigué ou affamé.
Vous avez oublié d'ajouter quelque chose
Vous obtenez des résultats étranges ? Pas de résultats du tout ? Il est possible que vous ayez simplement oublié d'ajouter un élément important à votre réaction. Reprenez vos étapes et vérifiez si vous n'avez pas oublié quelque chose.
Mauvaises conditions de PCR utilisées
De nombreux appareils vous offrent la possibilité de sauvegarder vos paramètres personnels. C'est une bonne chose si vous avez plusieurs groupes avec des protocoles différents travaillant sur la même machine et cela accélère la préparation de votre expérience à chaque fois, mais bien sûr cela peut s'avérer un piège si vous sélectionnez par hasard le mauvais paramètre de sauvegarde pour votre réaction. Vérifiez toujours que vous avez sélectionné le bon paramètre avant de commencer.
Température de recuit trop élevée
Il est parfois difficile de déterminer la meilleure température pour votre réaction. Un bon moyen de trouver la meilleure température est d'utiliser une machine PCR dotée d'une fonction de gradient. Vous pouvez effectuer une PCR en gradient pour tester plusieurs températures de recuit à la fois, que vous pouvez ensuite utiliser pour comparer et choisir la température qui vous donne la bande désirée la plus brillante.
Oubli de colorant dans le gel d'agarose
Si vous effectuez un gel et que vous ne voyez rien dans vos résultats, il se peut que vous ayez oublié d'ajouter un colorant. Un moyen pratique de contourner ce problème est d'obtenir un gel pré-coulé contenant déjà le colorant.
En plus de ces outils et conseils destinés à vous faciliter la vie au laboratoire et à réduire les risques d'erreurs d'utilisation, nous vous recommandons également de faire des pauses régulières, de dormir suffisamment, de manger et d'absorber de la vitamine D.