Invitrogen™ Test de prolifération de l’EdU Click-iT™ pour microplaques

Une fois que l’EdU (un analogue à la thymidine modifiée) est incorporé dans l’ADN nouvellement synthétisé, la peroxydase de raifort se fixe de manière covalente par le biais de la réaction click hautement spécifique. Le réactif Amplex UltraRed, un substrat de la peroxydase de raifort, est ensuite ajouté et le signal de fluorescence qui en résulte est détecté. En raison de la fixation hautement spécifique de la peroxydase de raifort à l’EdU, ce dosage permet de mesurer de façon très sensible et fiable la prolifération des cellules mammifères sur une microplaque.

Caractéristiques du système de dosage de la prolifération de l’EdU Click-iT pour microplaques :
• Performances améliorées — Conjugaison directe de la peroxydase de raifort à l’EdU incorporé afin d’améliorer la sensibilité et la précision des dosages
• Fiabilité accrue — Format de dosage synonyme d’une faible variabilité entre les puits
• Protocole simplifié — Réduction du délai nécessaire pour obtenir des données ; protocole plus facile à suivre
• Multiplexage possible — Dosage facilement multiplexable avec d’autres réactifs de santé cellulaire, ce qui augmente le nombre de données disponibles par échantillon

. La mesure de la prolifération cellulaire est une méthode fondamentale pour apprécier la santé des cellules, déterminer la génotoxicité et évaluer les médicaments anticancéreux. La méthode la plus précise pour mesurer la prolifération consiste à détecter directement la synthèse d’ADN. À l’origine, ceci était effectué en incorporant des nucléosides radioactifs (c.-à-d., la ³H-thymidine). Cette méthode a été remplacée par la détection à base d’anticorps de l’analogue de nucléoside, bromodésoxyuridine (BrdU). Une fois le BrdU incorporé dans l’ADN nouvellement synthétisé, il est nécessaire de procéder à la dénaturation afin d’exposer les molécules de BrdU à l’anticorps anti-BrdU. La dénaturation implique des méthodes difficiles (HCl, chaleur ou enzymes) qui demandent beaucoup de temps et qui sont difficiles à réaliser de manière cohérente.

L'essai de prolifération de l’EdU Click-iT constitue une alternative au dosage BrdU. L’EdU, cet analogue nucléosidique (5-éthynyl-2´-désoxyuridine), est ajouté aux cellules vivantes et incorporé à l’ADN durant la synthèse active de l’ADN. L’EdU incorporé contient un groupe d’alcyne qui se joint de manière covalente au groupe azoture présent dans la peroxydase de raifort à l’aide d’une réaction covalente hautement spécifique catalysée par le cuivre (“réaction click”). Le réactif Amplex UltraRed est ensuite ajouté et converti par la peroxydase de raifort en produit hautement fluorescent qui est enregistré à l’aide d’un lecteur de microplaques par fluorescence (excitation : 568 nm, émission : ∼585 nM). Avec un coefficient d’extinction élevé, une efficacité quantique et une résistance à l’auto-oxydation remarquables, le réactif Amplex UltraRed offre une sensibilité plus élevée et une plage de dosage plus large que les autres substrats de peroxydase de raifort fluorogéniques ou colorimétriques. Il s’avère également polyvalent en matière de détection grâce à des mesures par fluorescence ou absorbance.