Invitrogen™ Flp-In™ T-REx™ Core Kit

• Une fois que la lignée cellulaire hôte Flp-InT-REx contenant le site FRT intégré a été créée, la génération ultérieure de lignées cellulaires Flp-InT-REx exprimant le(s) gène(s) d’intérêt est rapide et efficace
• Permet la génération de lignées cellulaires stables isogènes et inductibles
• Permet la sélection polyclonale de lignées cellulaires à expression stable
• Pour générer la lignée cellulaire hôte Flp-inT-REx pour l’expression du gène, la lignée cellulaire de mammifères est d’abord transfectée séquentiellement avec pFRT / lacZeo et pcDNA6 / TR, qui s’intègrent tous deux de manière aléatoire et indépendante dans le génome de l’hôte
• Le premier contient le site FRT (pour la recombinaison intermoléculaire homologue) juste en aval du codon d’initiation de la fusion lacZ-Zeocin
• Le dernier exprime constitutivement le répresseur de la tétracycline, qui permettra de réguler l’activité du promoteur de TetO₂
• L’étape suivante de la génération de la lignée cellulaire inductible consiste à co-transfecter les vecteurs pOG44 et pcDNA5 / FRT / TO, dont le dernier contient un gène d’intérêt sous contrôle du promoteur CMV / TetO₂ régulé par la tétracycline, dans la lignée cellulaire hôte
• La recombinaison homologue entre les sites FRT dans le pcADN5 / FRT / TO et sur le chromosome de la cellule hôte, catalysée par la recombinase Flp exprimée à partir du pOG44, génère des lignées cellulaires dérivées dans lesquelles le gène a été intégré de manière stable dans le chromosome de la cellule hôte
• Ces cellules peuvent être sélectionnées et maintenues à l’aide de la résistance à l’hygromycine et à la blasticicine acquise en raison de l’événement de recombinaison

Expression de cellules de mammifères, Expression de protéines, Protéines, Expression, Isolement et analyse, Expression régulée, Intégration ciblée