Kit d’expression Multi-Copy Pichia

• Le kit d’expression multi-copies Pichia contient les vecteurs pPIC3.5K, pPIC9K et pAO815 pour la production et la sélection de souches Pichia qui contiennent plusieurs copies du gène concerné.
• Dans de nombreux cas, l’augmentation du nombre de copies a entraîné une augmentation des niveaux d’expression.
• Ces vecteurs sont également disponibles séparément.

pPIC9K et pPIC3.5K

• Les vecteurs pPIC9K et pPIC3.5K portent le gène de résistance à la kanamycine qui confère une résistance au réactif Geneticin™ dans Pichia.
• La génération spontanée de plusieurs événements d’insertion peut être identifiée par la résistance à des niveaux accrus de réactif Geneticin™.
• Les transformants Pichia sont sélectionnés sur un milieu déficient en histidine et sélectionnés en fonction de leur niveau de résistance au réactif Geneticin™.
• La capacité de croître à de fortes concentrations de Geneticin™ indique que de multiples copies du gène de résistance à la kanamycine et du gène d’intérêt sont intégrées au génome.
• Le vecteur pPIC9K dirige la sécrétion des protéines exprimées alors que les protéines exprimées à partir de pPIC3.5K restent intracellulaires.

pAO815

• pAO815 est un vecteur d’expression Pichia conçu pour cloner plusieurs copies d’un gène dans un seul vecteur.
• Le vecteur contient un site Bgl II en amont du gène 5´ AOX1 et un site BamH I unique en aval du signal de terminaison de transcription 3´ AOX1 (TT).
• Quatre étapes sont nécessaires pour générer plusieurs copies du gène d’intérêt :
  • 1. Le gène est cloné dans le site EcoR I unique du vecteur.
  • 2. La construction est digérée avec du BamH I et du Bgl II pour libérer la “cassette d’expression” qui contient le promoteur AOX1, le gène concerné et le 3´ AOX1 TT.
  • 3. Les concatémères de la cassette d’expression sont générés par ligature in vitro.
  • 4. Les copies multiples sont réinsérées dans le vecteur pAO815 et transformées en Pichia.