Thermo Scientific™ Kit de biotinylation et d’isolement de surface cellulaire™ Pierce

Caractéristiques du kit de biotinylation et d’isolement des protéines de surface cellulaire :
• Performances améliorées — le kit et le protocole ont été reconçus pour améliorer l’enrichissement et l’extraction des protéines de la membrane plasmique biotinylée tout en minimisant la contamination des protéines intracellulaires
• Optimisé — le protocol a été actualisé pour réduire le temps de traitement et le nombre des étapes ; les formulations de réactifs ont été optimisées pour améliorer les performances
• Compatible — les réactifs ont été vérifiés avec des lignées cellulaires adhérentes et en suspension, sur la base d’instructions supplémentaires fournies pour la préparation d’échantillons MS
• Applications validées — les réactifs et procédures d’application sont compatibles avec les applications de transfert Western et MS

Ce kit facile à utiliser fournit tous les composants et procédures nécessaires pour un marquage optimal et un isolement ultérieur des protéines de surface cellulaire. Les tampons sont fournis pré-formulés pour produire des résultats cohérents. Les cellules de mammifères sont d’abord marquées avec EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin, un réactif de biotinylation réactif à l’amine, clivable par thiol. Les cellules sont ensuite lysées et les protéines marquées sont capturées avec l’agarose NeutrAvidin. Le dithiothréitol (DTT) est utilisé dans l’élution pour réduire les liaisons disulfures dans le marquage de biotine, ce qui libère les protéines liées sans le marquage de biotine. Ce kit contient suffisamment de réactifs pour huit expériences : il comprend deux boîtes de 15 cm confluentes de 85 à 95 % ou quatre flacons de 75 cm².

Les protéines de surface cellulaire représentent un sous-ensemble clé des protéines cellulaires et jouent un rôle majeur dans la transduction du signal, l’adhérence cellulaire et le transport des ions. Ces protéines sont difficiles à extraire et à isoler efficacement en raison de leurs multiples domaines de recouvrement de la membrane. Souvent, les détergents agressifs et les conditions nécessaires à une extraction efficace entraînent une dénaturation et une contamination des protéines de la membrane plasmique après l’isolement. Comme alternative, ce kit utilise une sulfo-NHS-SS-biotin imperméable à la membrane, réactive à l’amine, pour étiqueter efficacement les protéines de surface cellulaire avec des lysines accessibles. Les conditions de la lyse, de la capture, du lavage et de l’élution ont été optimisées pour un enrichissement et un isolement efficaces tout en minimisant la contamination des protéines intracellulaires.

Le protocole a été optimisé pour une utilisation avec diverses lignées cellulaires de mammifères, y compris les cellules adhérentes et en suspension ; il est utile pour l’analyse de l’expression différentielle entre les cellules traitées et non traitées ou entre une ou plusieurs lignées cellulaires. La sélectivité et l’efficacité de l’isolement des protéines de surface cellulaire ont été vérifiées par transfert Western et analyse LC-MS.