Thermo Scientific™ Milieu limitant de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM-LM)

La L-Photo-Leucine et la L-Photo-Méthionine Thermo Scientific sont des analogues des acides aminés L-Leucine et L-Méthionine qui ont des chaînes latérales activables de la diazirine capables d’établir une réticulation chimique aux molécules adjacentes lorsqu’elles sont exposées à la lumière ultraviolette. Comme leurs homologues naturels, ces acides aminés photoréactifs peuvent être incorporés de manière endogène dans la séquence primaire des protéines pendant la synthèse. Les domaines d’interaction de protéine à protéine impliquant les protéines synthétisées dans leur environnement natif peuvent alors être étroitement liés en activant les groupes de diazirines. Les expériences traditionnelles de réticulation nécessitent l’ajout de réticules chimiques bifonctionnels et de solvants de réactifs associés, ce qui peut nuire à la biologie cellulaire étudiée. L’utilisation d’acides aminés photoréactifs minimise ces effets potentiellement indésirables et permet d’étudier et de caractériser les interactions protéiques stables et transitoires dans les cellules avec un degré élevé de confiance. Lorsqu’elles sont utilisées en association avec des milieux cellulaires limitants spécialement formulés qui sont dépourvus de leucine et de méthionine, les dérivés photo-activables sont traités comme des acides aminés naturels par la machine de synthèse des protéines. Par conséquent, ils peuvent être substitués à la leucine ou à la méthionine dans la séquence primaire des protéines. Lorsqu’ils sont exposés à la lumière UV, les anneaux de diazirine deviennent des intermédiaires réactifs qui forment des liaisons covalentes avec des chaînes latérales et des structures protéiques proches. Les partenaires de liaison associés naturellement sont alors piégés instantanément. Les complexes protéiques réticulés sont détectés par une mobilité réduite sur SDS-PAGE suivie d’une détection par transfert Western, d’une chromatographie d’exclusion stérique, d’une sédimentation par gradient de densité de saccharose ou d’une spectrométrie de masse.

Points clés :

• Marquage in vivo : intègre le groupe photoréactif aux protéines à l’aide d’outils cellulaires normaux

• Réticulation in vivo : permet de trouver des protéines interagissant dans l’environnement cellulaire natif

• Spécificité accrue par rapport aux méthodes traditionnelles : réticulation interagissant avec les protéines correctement positionnées à leurs interfaces dans les domaines d’interaction entre protéines

• Complémentaire aux méthodes traditionnelles : fournit une caractérisation détaillée des interactions entre protéines par rapport aux résultats avec le formaldéhyde et d’autres approches plus générales de réticulation

• Récupération efficace : 90 % de récupération de protéines dans les lysats cellulaires après réticulation

• Compatible : réticule les protéines exprimées dans une grande variété de lignées cellulaires, notamment HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH 3T3 et C6

• Facile à utiliser : les réactifs sont photostables sous un éclairage de laboratoire normal, éliminant ainsi le besoin de travailler dans l’obscurité