Invitrogen™ Kit d’activité colorimétrique PKA (protéine kinase A)

Le kit d’activité PKA à usage exclusif est un test d’activité colorimétrique conçu pour la quantification et la détection de l’activité de la protéine kinase A dans les lysats cellulaires, les extraits de tissus et les échantillons de tampons.

Ce kit complet, prêt à l’emploi, comprend une (des) plaque(s) à 96 puits enduite(s) de substrat PKA, un étalon PKA (5 000 U), un anticorps de substrat phospho-PKA et d’autres composants pour réaliser l’essai. Un lecteur de microplaques à 96 puits capable de lire la densité optique à 450 et 650 nm est nécessaire pour l’utilisation de ce kit.

Caractéristiques de performances
• Type d’essai : kit d’activité colorimétrique
• Types d’échantillons : lysats cellulaires, extraits de tissus, échantillons tampons
• Sensibilité : 0,366 U/ml
• Plage de la courbe standard : 5–25 U/ml
• Réactivité : indépendante des espèces

Contexte
La PKA fait partie d’une importante classe de kinases, appelées kinases dirigées par Arg ou kinases de la famille AGC, qui comprend la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA ou PKAc), la protéine kinase dépendante du BPFa (PKG), la protéine kinase C, l’Akt et la RSK. Ces kinases partagent une spécificité de substrat caractérisée par la présence d’Arg en position 3 par rapport à la sérine ou à la thréonine phosphorylée. Le second messager, l’AMP cyclique (AMPc), active la PKA dans les cellules de mammifères et contrôle de nombreux mécanismes cellulaires tels que la transcription des gènes, le transport des ions et la phosphorylation des protéines2. La protéine PKA inactive est un hétérotétramère composé d’une sous-unité régulatrice (R) et d’une sous-unité catalytique (C). Dans cet état inactif, les séquences de pseudosubstrat sur les sous-unités R bloquent les sites actifs sur les sous-unités C. La protéine PKA partage la spécificité du substrat avec l’Akt (PKB) et la PKC. Les substrats qui présentent cette séquence consensus et sont phosphorylés par la PKA sont Bad (Ser155), CREB (Ser133) et GSK-3.

La PKA a été impliquée dans de nombreux processus cellulaires, notamment la modulation d’autres protéines kinases, la régulation de la concentration de calcium intracellulaire et la régulation de la transcription. Les réponses transcriptionnelles à l’augmentation de l’AMPc se produisent par l’activation de la protéine de liaison de l’élément de réponse à l’AMPc (CREB), du modulateur de l’élément de réponse à l’AMPc (CREM) et du facteur de transcription activateur 1 (ATF1). Chacun de ces facteurs de transcription contient un domaine inductible par la kinase contenant un site conservé pour la phosphorylation par la PKA.

Principe de l’essai
Le kit d’activité PKA est conçu pour mesurer quantitativement l’activité PKA dans différents échantillons. Un étalon de PKA recombinant est fourni pour générer une courbe d’étalonnage pour le dosage et tous les échantillons doivent être lus à partir de la courbe d’étalonnage. Le kit utilise un substrat PKA immobilisé lié à une plaque de microtitration. Les échantillons contenant de la PKA vont, en présence de l’ATP fourni, phosphoryler le substrat PKA immobilisé. Après une incubation de 90 minutes suivie d’un lavage, un anticorps de lapin spécifique du substrat phospho-PKA se lie au substrat immobilisé modifié. Un anticorps spécifique de l’IgG de lapin marqué à la peroxydase est également ajouté à la plaque pour se lier au substrat anti-phospho-PKA de lapin. Après une courte incubation et un lavage, le substrat est ajouté et l’intensité de la couleur développée est directement proportionnelle à la quantité de PKA dans les échantillons et les étalons.