Invitrogen™ Thiol Fluorescent Detection Kit

Le kit de détection de thiol protéique, à usage de recherche uniquement, est un test fluorescent conçu pour la quantification et la détection du thiol protéique dans les tampons biologiques courants, notamment les tampons biologiques et les tampons Tris, phosphate et citrate.

Ce kit complet prêt à l’emploi comprend une ou plusieurs plaques noires à 96 puits, un étalon de N-acétylcystéine, un réactif de détection, un tampon de dosage et d’autres composants pour effectuer le dosage. Ce kit nécessite l’utilisation d’un lecteur de microplaques à 96 puits capable de lire les émissions fluorescentes à 510 nm, avec excitation à 390 nm.

Caractéristiques de performance
• Type de dosage : kit de détection par fluorescence
• Types d’échantillons : tampons biologiques courants, y compris les tampons Tris, phosphate et citrate
• Sensibilité : 4,62 nM
• Plage de la courbe standard : 78–10 000 nM
• Réactivité : indépendante de l’espèce

Contexte
Les thiols libres dans les systèmes biologiques jouent des rôles importants. Les groupes thiols de résidus de cystéine ayant subi des modifications oxydatives sont connus pour moduler l’activité d’un nombre croissant de protéines. L’un des problèmes les plus urgents de cette approche consiste à déterminer avec précision l’étendue de la modification des acides aminés spécifiques, tels que les résidus de cystéine, dans un échantillon protéique complexe, en particulier en présence d’agents chaotropiques comme le chlorhydrate de guandine.

Ce kit de détection de thiol par fluorescence permet aux utilisateurs de déterminer avec précision la teneur en thiol libre dans les échantillons à l’aide d’un réactif de détection non fluorescent exclusif, qui est converti en un produit à fluorescence très lumineuse lors d’une réaction avec le thiol dans l’échantillon. Le thiol de l’échantillon peut être soit un thiol généré par une réaction, comme le produit final d’une réaction enzymatique telle que le glutathion, soit la teneur en cystéine de la protéine à mesurer. Ce dosage a été testé avec des échantillons dans des concentrations de chlorhydrate de guanidine allant jusqu’à 2 M dans le tampon de dosage fourni dans le kit. Ceci permet de déterminer avec précision la teneur en thiol des protéines dépliées. Bien qu’un dérivé de cystéine ait été fourni comme étalon pouvant être utilisé pour quantifier les cystéines libres sur des peptides et des protéines, le dosage doit être étalonné à un étalon aussi proche que possible chimiquement du thiol mesuré. Par exemple, si l’utilisateur final mesure le glutathion avec le kit, le dosage doit être étalonné selon une préparation standard de glutathion connue et validée.

Principe du dosage
Le kit de détection de thiol protéique par fluorescence est conçu pour mesurer quantitativement les groupes thiol générés ou présents dans des échantillons biologiques. Un étalon est fourni pour générer une courbe d’étalonnage pour le dosage et tous les échantillons doivent être lus à partir de la courbe d’étalonnage. Les échantillons et étalons sont pipetés dans une plaque de microtitration noire. Après mélange de l’échantillon ou de l’étalon au réactif de détection et incubation à température ambiante pendant 30 minutes, le produit fluorescent est lu à 510 nm dans un lecteur de plaques fluorescentes avec excitation à 390 nm. Étant donné que les thiols libres générés biologiquement, tels que le glutathion et les groupes de thiols protéiques, existent dans différents environnements, la quantité de thiol présent ou généré doit être étalonnée à l’aide d’un étalon approprié.