La technologie de la bio-impression s'est développée parallèlement à la recherche sur les cellules souches et est devenue un outil essentiel aux applications diverses dans les domaines biologique et médical. Les techniques de culture cellulaire in vitro en 3D créent un environnement in vitro précis et constituent une alternative aux modèles in vivo utilisés pour la recherche fondamentale en biologie cellulaire et en physiologie. Toutefois, ces applications sont actuellement entravées par la variabilité des organoïdes, le faible débit et l'échelle limitée. Bien que l'on s'attende à ce que la technologie de la bio-impression soit appliquée à la médecine régénérative et à la découverte de médicaments, l'impact des distributeurs de cellules sur l'intégrité des cellules continue de susciter des inquiétudes.
Bio-impression avec des suspensions cellulaires et des fragments d'organoïdes intestinaux
Le bioprinter Corning™ Matribot™ a présenté des performances de distribution respectueuses des cellules similaires à celles de l'opération de distribution manuelle. La culture distribuée par le bioprinter Corning™ Matribot™ était adaptée à des analyses moléculaires et protéiques plus poussées ainsi qu'à des applications en aval, notamment le criblage de médicaments à haut débit.
La matrice Corning Matrigel™ a été pré-décongelée et aliquotée conformément au manuel. Tous les embouts et la seringue utilisés pour manipuler les sphéroïdes ou les organoïdes ont été pré-réfrigérés. Les milieux ont été équilibrés à température ambiante (15°C à 25°C) avant utilisation. Les cellules A549 et MDCK ont été cultivées dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle's Medium supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal jusqu'à ce qu'elles atteignent 90% de confluence.
Le milieu a été éliminé par aspiration et les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate et dissociées en cellules individuelles à l'aide d'une solution de trypsine-EDTA à 0,25 %. Un volume égal de milieu complet a ensuite été ajouté aux cellules et mélangé. La suspension a été centrifugée à 300 x g pendant 3 minutes, le surnageant a été jeté et le culot a été remis en suspension dans la matrice Corning Matrigel™ non diluée.
Un volume égal de milieu complet (DMEM + 10% FBS) a ensuite été ajouté aux cellules et mélangé. La suspension a été centrifugée à 300 x g pendant 3 min, le surnageant a été jeté et le culot a été remis en suspension dans la matrice Corning Matrigel™ non diluée. La densité cellulaire finale a été ajustée à 50 cellules/μL. Le mélange de la matrice Matrigel et des cellules a été transféré dans une seringue, inséré dans la tête d'impression de la bioprinter Corning Matribot, et distribué en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 1. La distribution manuelle a été effectuée à l'aide d'une pipette à un canal. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 15 minutes, puis le milieu complet (1 ml) a été ajouté à chaque puits. Les plaques ont été incubées à 37°C et 5% de CO2, et le milieu a été changé tous les 2 à 3 jours.
"Nous avons démontré que les cultures 3D dispensées à l'aide de la bioprinter Corning™ Matribot™ étaient comparables à celles obtenues par opération manuelle. Les deux méthodes ont apporté une morphologie similaire, des types de cellules composantes et un profil d'expression génique."
Les organoïdes intestinaux de souris (MIO) ont été décongelés, cultivés et passés dans le milieu de croissance complet IntestiCult™ organoïde, conformément aux instructions du fabricant, jusqu'à l'obtention d'une densité d'environ 150 organoïdes/puits. Une pipette de 1 000 μL pré-humidifiée a été utilisée pour fragmenter les organoïdes en pipettant de haut en bas 20 fois, suivi d'une centrifugation à 290 x g pendant 5 min à 4°C. Le surnageant a été soigneusement jeté, et le culot a été remis en suspension dans la matrice Matrigel™ non diluée en pipettant de haut en bas 10 fois. Le mélange de matrice Matrigel™ et de suspension MIO a été transféré dans une seringue, inséré dans la tête d'impression de la bioprinter Corning Matribot et distribué en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 1. La distribution manuelle a été effectuée à l'aide d'une pipette à canal unique. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 15 minutes, puis un milieu de croissance organoïde IntestiCult complet (1 ml) a été ajouté à chaque puits. Le milieu a été changé trois fois par semaine.
Résultats et discussion
La morphologie des sphéroïdes A549 générés à partir d'échantillons distribués par bioprinter et manuellement semblait avoir des formes normales. Après 7 jours de culture, les sphéroïdes MDCK distribués par bioprinter et manuellement ont montré des structures kystiques évidentes et typiques (Figure 1B). Des structures MIO complexes et multilobées ont également été observées après 5 jours de culture. De plus, les densités des cultures 3D formées étaient comparables entre les échantillons distribués par bioprinter et ceux distribués manuellement.
Une coloration par immunofluorescence a été réalisée pour étudier la présence de marqueurs de types cellulaires spécifiques dans les cultures 3D. Une quantité importante de F-actine jonctionnelle a été observée aux points de contact cellule-cellule dans les sphéroïdes A549, ce qui indique que des interactions adhésives intercellulaires stables et fortes ont été formées. De plus, les cultures 3D de cellules A549 ont montré un marquage brillant et continu de la E-cadhérine à la surface des cellules et aux sites de contact cellule-cellule. Par conséquent, la coloration par immunofluorescence a confirmé que la F-actine et la E-cadhérine étaient fortement exprimées dans les sphéroïdes A549 générés à la fois par bioprinting et par distribution manuelle.
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