Thermo Scientific™ EpiJET 5-hmC and 5-mC Analysis Kit

Le kit d’analyse de 5-hmC et 5-mC EpiJET comprend trois enzymes complexes : F β-glucosyltransférase (T4 BGT), Epi MspI et Epi HpaII. Epi MspI et Epi HpaII sont des isoschisomères avec une sensibilité différente à la méthylation C interne du site CCGG. Epi MspI digère complètement l’ADN génomique lorsque la cytosine, la 5-méthylcytosine (5-mC) ou la 5-hydroxyméthylcytosine (5-hmC) se trouve dans sa séquence de reconnaissance, mais son activité est complètement bloquée lorsque la 5-hmC est glucosylée. Epi HpaII clive uniquement le site CCGG non modifié.

Le kit tire parti de la capacité de la T4 BGT à modifier spécifiquement les résidus de 5-hmC en ajoutant la fraction de glucose à la 5-hmC et la sensibilité de l’enzyme de restriction Epi MspI à la 5-hmC glucosylée. La T4 BGT est formulée pour une glucosylation hautement spécifique, complète et rapide de la 5-hmC en 15 minutes.

L’analyse implique la glucosylation des échantillons d’ADN et la digestion de restriction subséquente avec Epi MspI et Epi HpaII. Les produits de digestion par enzymes de restriction sont ensuite analysés par qPCR avec une paire d’amorces flanquant le site CCGG d’intérêt.

Points clés

• Efficacité et fiabilité : quantification précise de 5-hmC et 5-mC
• Robuste : large plage (de 0,2 μg à 4 μg) d’ADN d’entrée
• Rapide : procédure terminée en 5 heures, pas d’incubation pendant la nuit

• Analyse et quantification de 5-hmC et 5-mC dans les séquences CCGG

• T4 β-glucosyltransférase, 5 U/μl
• Tampon 10X Epi
• 10X UPD–glucose
• Epi MspI
• Epi HpaII
• ADN de contrôle 5-hmC
• ADN de contrôle 5-mC
• ADN de contrôle non modifié
• Amorce de contrôle 1
• Amorce de contrôle 2
• Eau, exempte de nucléase
• Protocole détaillé