Trouver de nouvelles méthodes de contrôle de la contamination des cultures cellulaires
Kris Wronski, Scientifique en applications de culture cellulaire pour la région EMEA chez Thermo Fisher Scientific, explique les dangers de la contamination microbienne indésirable dans les laboratoires de culture cellulaire et comment la contamination peut avoir un impact direct sur la croissance cellulaire et la santé cellulaire globale.
Comment la contamination des cultures cellulaires peut avoir un impact sur les résultats
La contamination est un problème courant dans de nombreux laboratoires, et dans les laboratoires de culture cellulaire, la contamination microbienne est un enjeu particulier.
La majorité des utilisateurs du laboratoire travaillent dur pour minimiser et réduire la contamination des cultures cellulaires en mettant en œuvre des mesures et des protocoles spécialisés, afin de se protéger eux-mêmes et les échantillons précieux. La contamination indésirable des cultures cellulaires peut affecter les attributs essentiels des cellules mammifères, ce qui, à son tour, peut avoir un impact significatif sur les résultats expérimentaux. Bien qu’il soit impossible d’éliminer toutes les sources de contamination des cultures cellulaires, des étapes peuvent être suivies pour réduire ou éviter que ce phénomène se produise en premier. “Je me concentre sur la contamination microbienne, lorsque des microorganismes indésirables trouvent un moyen d’entrer dans une culture de cellules de mammifères et détruisent l’expérience en influençant les résultats expérimentaux. Par exemple, les virus sont presque impossibles à détecter lorsqu’ils infectent une culture cellulaire, car ils ne laissent aucun indice visuel de leur présence. De plus, ils ne provoquent pas de variation du pH dans un milieu de culture cellulaire. Par conséquent, il est très difficile de déterminer si nous sommes en présence d’une contamination virale”, explique Wronski. Cela signifie qu’il peut être presque impossible pour les utilisateurs du laboratoire de déterminer si une expérience a été contaminée par un virus, ce qui rend la contamination virale difficile à gérer et à contrôler.
“La contamination bactérienne et fongique est l’une des principales causes de contamination, et les bactéries et champignons se développent rapidement dans un milieu de culture cellulaire. C’est logique, car tout environnement propice à la croissance des cultures de cellules de mammifères est également idéal pour le développement des bactéries et champignons”, précise Wronski. Heureusement, il est assez facile de détecter la présence de contamination bactérienne ou fongique dans les cultures cellulaires. Par exemple, certaines espèces de moisissures se présentent sous une forme “cupuliforme”, qui a tendance à se placer au sommet des cultures de cellules de mammifères. “La plupart des bactéries et champignons peuvent commencer assez rapidement à causer la mort des cellules mises en culture, car ils rendent le milieu de culture plus acide et se développent plus rapidement que les cellules animales mises en culture, aspirant et utilisant tous les nutriments d’un milieu de culture et privant les précieuses cellules de nutriments”, explique Wronski.
"En particulier, le type le plus grave de contamination des cultures cellulaires est la contamination microbienne liée aux mycoplasmes."
Les mycoplasmes constituent un genre de bactéries qui peut être pathogène pour les humains et les animaux. Il est intéressant de noter que les mycoplasmes n’ont pas de paroi cellulaire autour de leurs membranes ; ce sont les plus petits organismes autoreproducteurs, mesurant environ 0,1 µm de diamètre. “Ce sont des contaminants très répandus dans les cultures cellulaires. D’un point de vue technique, les mycoplasmes sont des bactéries, ce dont beaucoup de personnes n’ont pas conscience, car ils sont bien plus petits que la plupart des bactéries, et en raison de leur taille, ils peuvent se multiplier à une vitesse effrénée dans une culture sans que l’on s’en rende compte.” Ce type de bactéries ne provoque pas de variation du pH dans un milieu de culture, ce qui signifie que de nombreuses expériences sont contaminées par des mycoplasmes sans que nous le sachions. “Ce qui est encore pire, en présence d’une contamination par des mycoplasmes, c’est que ces derniers n’ont pas de paroi cellulaire, et cela entraîne une résistance à la plupart des antibiotiques.” De plus, en raison de leur petite taille, ils peuvent parfois passer à travers les filtres de stérilisation. “Au-delà des signes basiques de croissance lente et de mauvaise transsection, les mycoplasmes peuvent affecter le métabolisme et la morphologie des cellules. Ils peuvent provoquer des altérations chromosomiques et même dégrader les acides nucléiques”, explique Wronski. Il n’est donc pas surprenant que la contamination des cultures cellulaires puisse avoir un impact significatif sur les résultats expérimentaux, ce qui représente un problème permanent pour de nombreux laboratoires de recherche et laboratoires commerciaux qui développent de nouveaux traitements et produits en ayant recours à des procédés de culture cellulaire.
La contamination au laboratoire
La contamination peut prendre de nombreuses formes au laboratoire, elle peut notamment provenir des techniciens, d’une mauvaise technique de laboratoire, de flacons fissurés et d’outils de laboratoire contaminés. “Je diviserais les facteurs responsables de la présence de contamination au laboratoire en quatre catégories, qui sont les suivantes : les consommables et les réactifs, l’équipement général de laboratoire, les facteurs environnementaux et la technique aseptique.”
Étonnamment, Wronski mentionne qu’une conservation incorrecte des réactifs contribue fortement à la contamination des cultures cellulaires. “Ce que l’on doit se demander, c’est si tous les éléments réactifs d’un milieu sont conservés à la bonne température. Une conservation incorrecte peut favoriser le développement d’une contamination.” En ce qui concerne la contamination introduite par l’équipement de laboratoire, Wronski explique : “La contamination introduite par l’équipement de laboratoire se produit lorsque vous n’avez pas complètement validé et établi des procédures normalisées d’exploitation pour l’entretien, le nettoyage et la désinfection de l’équipement, ce qui peut favoriser davantage la contamination.” Les facteurs environnementaux sont une autre cause de la survenue d’une contamination et incluent les personnes travaillant au laboratoire ainsi qu’une climatisation insuffisante. “En tant qu’êtres humains, nous avons besoin de microbes symbiotiques sur notre peau pour fonctionner normalement, mais nous pouvons également être des vecteurs de microbes hautement pathogènes et indésirables. Nous pouvons apporter des spores de culture avec nous au laboratoire sur nos vêtements ou même sous nos chaussures.”
Il est intéressant de noter qu’il est également important de tenir compte du moment de l’année lorsque l’on réfléchit à la contamination des cultures cellulaires, en particulier la contamination fongique. “Certaines personnes ont différents types d’allergies et de problèmes respiratoires associés aux champignons produisant des spores et ceux-ci flottent dans l’air. Concernant les moisissures, elles peuvent se développer sur presque tout en présence d’humidité.” Wronski poursuit : “Les différentes spores fongiques sont plus ou moins présentes dans l’air selon la période de l’année ou la région géographique. En Europe, les spores fongiques sont généralement très présentes dans l’air de fin juin à août, et certaines journées de septembre. Cela étant dit, les spores fongiques peuvent être introduites tout au long de l’année par nous-mêmes et le système de climatisation utilisé dans les laboratoires de culture cellulaire.” Pour mieux gérer ce problème, Wronski a indiqué que des évaluations des risques appropriées et des mécanismes de prévention doivent être mis en place par les directeurs de laboratoires et les techniciens.
Évaluation du risque de contamination des cultures cellulaires
Le risque de contamination des cultures cellulaires peut être évalué de nombreuses façons, cependant, chaque laboratoire est différent et choisira d’aborder la contamination différemment. Wronski explique : “Généralement, afin de mettre en œuvre des procédures appropriées, vous devez adopter une approche fondée sur le risque. Vous devez définir des procédures d’enquête étape par étape pour déterminer en conséquence les causes possibles de la contamination. Il est important d’être très méthodique dans l’enquête.” C’est la raison pour laquelle il est essentiel que les utilisateurs du laboratoire retracent toutes les étapes suivies au laboratoire afin de mieux définir la cause possible de contamination. Par exemple, l’équipement de laboratoire, la technique aseptique et la manière dont les consommables et réactifs sont gérés peuvent influencer la façon dont les cellules se développent et prospèrent dans une culture.
Wronski précise : “Il est essentiel d’étudier la manière dont chaque équipement de la chaîne est utilisé au quotidien. L’équipement est-il utilisé exactement de la même manière par chaque membre d’un laboratoire ? L’équipement dont il faut tenir compte peut comprendre les congélateurs, les incubateurs à CO2, les centrifugeuses, les réservoirs d’azote liquide et les pipettes. Par exemple, si les pipettes ne sont pas désinfectées correctement et non entretenues régulièrement, elles peuvent contribuer au problème en propageant davantage la contamination. En outre, si les bains-marie ne sont correctement entretenus, ils peuvent également être une source importante de contamination.” Dans le cas des incubateurs à CO2, s’ils sont positionnés les portes face aux portes principales du laboratoire ou aux bouches de climatisation, chaque fois qu’un utilisateur du laboratoire ouvre la porte de l’incubateur, les courants d’air chargés de poussières et de microbes entrent dans la chambre d’incubation, augmentant le risque de contamination des cultures cellulaires et compromettant les précieuses expériences.
Repensez votre équipement de laboratoire
De nombreux scientifiques ne savent peut-être pas que le type d’équipement de laboratoire qu’ils choisissent d’utiliser peut avoir un impact direct sur la croissance et la santé cellulaires. “Les caractéristiques de conception et les performances de l’équipement peuvent avoir un impact direct sur la croissance et la viabilité cellulaires, et même l’équipement général de laboratoire tel que les centrifuges, les postes de sécurité microbiologique et les incubateurs à CO2 peut également avoir une incidence”, explique Wronski. Par exemple, dans le cas des incubateurs à CO2, tous les paramètres associés auront une incidence sur la santé cellulaire, comme la température, l’injection de CO2 et l’humidité. L’incubateur doit pouvoir reproduire les conditions du corps d’où proviennent les cellules, en particulier lors de l’utilisation de cellules primaires. “Les incubateurs à CO2 doivent fournir un environnement uniforme, les cellules réagissant aux changements mineurs de l’environnement”, indique Wronski. Ainsi, une variation dans l’incubateur entraîne une variabilité incontrôlée des cellules et, en conséquence, des résultats expérimentaux inexacts. “De nombreuses fonctionnalités peuvent désormais être incorporées aux incubateurs à CO2 pour garantir que ces paramètres restent uniformes.”
Il est également important que les utilisateurs tiennent compte du type de capteurs utilisés avec un incubateur à CO2, ainsi qu’un réservoir d’eau de grande capacité intégré et protégé. “Autre caractéristique à prendre en compte, les capteurs de haute qualité tels que les capteurs infrarouges qui sont conçus pour surveiller et refléter avec précision le niveau de CO2.” Wronski poursuit : “J’utilisais les incubateurs à CO2 avec un simple bac à eau, que je faisais simplement glisser dans l’incubateur, mais il était toujours sujet à la contamination car l’eau était exposée à l’air. Aujourd’hui, des réservoirs d’eau protégés sont disponibles dans le commerce et lorsqu’ils sont utilisés en association avec un système de flux d’air, vous pouvez créer un environnement uniforme pour permettre à vos cellules de prospérer et protéger votre travail de la contamination. Vous pouvez désormais incorporer différentes technologies pour vous faciliter la vie et garder vos cellules en bonne santé”, explique Wronski.
Les facteurs décrits par Wronski peuvent tous contribuer à un rétablissement rapide de tous les paramètres critiques pour aider au maintien d’une excellente uniformité, en particulier lorsque des conditions hypoxiques sont requises. “Sans une légère circulation d’air active dans la chambre, il est impossible de répartir uniformément les différents gaz dans la chambre. Par conséquent, des cellules situées sur des étagères différentes ne reçoivent pas les mêmes quantités d’oxygène ou de CO2. Cela peut être préjudiciable aux cellules sensibles et peut nuire à l’obtention de résultats reproductibles.”
Votre équipement de laboratoire est-il facile à nettoyer ?
Aussi simple que cela puisse paraître, il est important de déterminer si l’équipement de laboratoire est facile à désinfecter et à nettoyer régulièrement. “Vous devez vous assurer que votre équipement est compatible avec les différents types d’agents et de désinfectants que vous prévoyez d’utiliser pour empêcher toute contamination. Par exemple, certains incubateurs à CO2 peuvent être en cuivre 100 % massif, comme l’incubateur à CO2 Thermo Scientific™ Heracell™ VIOS™. De nombreuses recherches ont été publiées sur le cuivre et ses propriétés antimicrobiennes”, explique Wronski. “Il faut faire attention, car de nombreux fabricants utilisent des slogans marketing habiles affirmant que leurs produits contiennent des pourcentages plus faibles de cuivre dans les alliages et cela peut vraiment diminuer l’effet antimicrobien. J’encourage les lecteurs et lectrices à faire des recherches indépendantes pour évaluer chacune de ces caractéristiques. Cela peut simplifier de nombreux processus au sein du laboratoire, et s’agissant des procédures de nettoyage, vous pouvez réduire la fréquence du nettoyage que vous devrez incorporer dans les activités quotidiennes.”
Concernant les incubateurs à CO2 et les cycles de stérilisation, il existe des moyens éprouvés et validés pour réduire la présence de contamination des cultures cellulaires, “Je recommande de rechercher des preuves de test et de validation des cycles de stérilisation conformes aux dernières normes de la Pharmacopée. En y regardant de plus près, les fabricants ne testent et ne valident pas toutes ces fonctionnalités de façon complète, conformément à la 10e édition des exigences de la Pharmacopée Européenne. De nombreux fabricants ne valident pas complètement les cycles et ne fournissent pas suffisamment de données avec tous les contrôles positifs et négatifs nécessaires et l’utilisation d’indicateurs biologiques corrects, lorsqu’ils effectuent ces validations. Par conséquent, il est essentiel que les scientifiques qui utilisent ces incubateurs mènent leurs propres recherches pour protéger les cultures cellulaires précieuses”, explique l’expert.
Il est également important de ne pas oublier l’équipement critique utilisé dans presque tous les laboratoires pour le traitement cellulaire tel que les centrifugeuses. Les centrifugeuses telles que le modèle Scientific™ Sorvall™ X4 Pro font désormais appel à une technologie de changement de rotor rapide qui aide les utilisateurs à désinfecter l’équipement rapidement et plus facilement qu’auparavant. “Je me souviens avoir eu affaire à des centrifugeuses par le passé, je n’arrivais pas à démonter le rotor très rapidement après chaque rotation ni à désinfecter efficacement la chambre de centrifugation. Ces procédures peuvent désormais être réalisées bien plus rapidement.” En ce qui concerne les postes de sécurité microbiologique, Wronski explique : “Certains postes de sécurité microbiologique tels que la série PSM Thermo Scientific™ Herasafe™ 2030i CTS incorporent différentes caractéristiques ; il est désormais notamment possible d’ouvrir complètement la fenêtre articulée à l’avant. Cela permet de nettoyer et de désinfecter complètement chaque partie du poste rapidement et efficacement. Certains fabricants réfléchissent à présent à la manière de nous simplifier la tâche et donc de nous faciliter la vie.”
Contribuer au développement cellulaire
Wronski indique : “Dans la culture cellulaire, on cesse d’utiliser les lignées cellulaires établies, qui sont cultivées pendant de nombreuses années par des laboratoires. Pour que les chercheurs génèrent des données expérimentales plus précises et exactes, il faut passer de ces lignées cellulaires à ce que l’on appelle les cellules primaires, qui sont directement issues du corps humain.” Ces cellules sont reconnues comme étant des cellules très fragiles et complexes à traiter, mais elles reproduisent mieux les conditions du corps et offrent donc une meilleure représentation du corps humain. “Les concentrations d’oxygène à l’intérieur du corps humain ou animal sont en fait beaucoup plus faibles que dans l’air que nous respirons. L’oxygène présent dans l’atmosphère représente 20 % de l’air, mais dans nos tissus, la concentration varie selon la distance des cellules par rapport aux poumons ou au sang artériel. Ainsi, les micro-environnements de ces cellules primaires dépendent de leur localisation dans notre corps,” explique Wronski. “Par conséquent, la culture de cellules dans un milieu pauvre en oxygène peut mieux reproduire les conditions à l’intérieur du corps, en particulier lors de l’utilisation de cellules primaires. C’est la raison pour laquelle les incubateurs tri-gaz ont vu le jour. Ceux-ci ont la capacité de créer l’atmosphère artificielle lorsqu’il s’agit de manipuler la concentration d’oxygène à l’aide d’azote.”
Il n’est donc pas surprenant que la contamination ait le potentiel d’endommager de nombreuses cellules et expériences précieuses, et puisse paralyser toute une expérience. Les laboratoires peuvent ainsi subir d’importantes pertes financières. Wronski conclut : “Vous devrez rejeter vos cellules lorsqu’il s’agit de recherche. Vous devrez tout recommencer. Cela peut coûter très cher, ce qui est difficile pour les laboratoires universitaires qui ne disposent pas de beaucoup d’argent grâce aux subventions.” Par conséquent, il est essentiel que les laboratoires prennent les mesures appropriées pour réduire la contamination des cultures cellulaires afin de protéger les échantillons précieux et leurs finances. Heureusement, les utilisateurs du laboratoire peuvent réduire le risque de contamination des cultures cellulaires de nombreuses façons comme l’a précédemment souligné Wronski, qui encourage désormais les scientifiques à mener leurs recherches de base et à déterminer quels équipements de laboratoire et protocoles employer pour générer des résultats très précis qui sont exempts de contamination.
