Comment réussir les applications de thérapie génique lorsque la reproductibilité expérimentale est essentielle ?
Introduction
Les thérapies géniques sont très prometteuses en ce qui concerne la mise à disposition de technologies transformatrices dans le monde au cours des prochaines années. Ces thérapies ciblées et complexes, qui fonctionnent généralement en introduisant des vecteurs contenant des gènes chez un patient, ont le potentiel de guérir des maladies rares et difficiles à traiter dans toute une série de domaines médicaux. Cependant, plusieurs défis doivent encore être relevés avant que la thérapie génique puisse tenir ses promesses. L'une des questions les plus importantes est celle de la reproductibilité expérimentale dans les phases de recherche et de découverte, qui se déroulent généralement dans un cadre universitaire. Malgré l'importance de la reproductibilité, il n'est pas rare d'entendre des collègues scientifiques essayer de reproduire les résultats de quelqu'un d'autre, mais sans y parvenir.
"Le succès de la thérapie génique dépend du développement de données reproductibles."
Il existe une infinité d'approches scientifiques et de procédures techniques complexes et, par conséquent, un résultat expérimental peut être difficile à reproduire. Toutes les parties impliquées dans le développement et la mise à disposition de médicaments de nouvelle génération doivent s'appuyer sur des preuves solides, dérivées de données, de leurs avantages afin de soutenir la prise de décision et d'assurer la traduction de découvertes prometteuses en thérapeutiques efficaces.
Nous soulignons ici certains obstacles à la reproductibilité expérimentale liés à l'équipement de laboratoire et formulons des recommandations sur la manière de les surmonter. Atteindre le plus haut niveau d'uniformité parmi les pratiques de laboratoire courantes est une nécessité absolue. Cela signifie que les scientifiques du laboratoire doivent être suffisamment formés et suivre strictement les procédures correctes pour l'utilisation et l'entretien du matériel de laboratoire. Dans le cadre de la recherche universitaire, ces protocoles sont conçus par les responsables de laboratoire sur la base des recommandations figurant dans les manuels d'utilisation fournis par les fournisseurs d'équipement. Comme il n'y a pas de règles spécifiques à suivre, les pratiques universitaires peuvent varier considérablement. Thermo Fisher Scientific™ reconnaît la nécessité de fournir une assistance supplémentaire sous la forme d'une variété de documents complets, y compris des notes techniques, d'application et intelligentes, pour couvrir chaque aspect de l'utilisation et de la maintenance de l'équipement. Tout cela dans le but de vous permettre de tirer le meilleur parti de votre équipement et d'augmenter la reproductibilité de vos données expérimentales.
Améliorer les pratiques de laboratoire à l'échelle de la recherche
Production de plasmides
Dans un cadre universitaire, les vecteurs viraux codant pour des plasmides sont généralement produits dans des cellules bactériennes Escherichia coli, sur des agitateurs orbitaux tels que les Thermo Scientific™ Solaris™ Agitateurs de laboratoire à température contrôlée. Si l'objectif est d'obtenir des plasmides de haute qualité, en quantité et de manière reproductible, certaines caractéristiques clés doivent être prises en considération. Par exemple, il a été démontré que des vitesses d'agitation allant jusqu'à 400 tr/min permettaient d'obtenir des rendements plus élevés et qu'il était important de limiter la circulation des micro-organismes, qui pourraient potentiellement contaminer la culture, pour garantir l'intégrité du produit final. De même, les caractéristiques qui facilitent un nettoyage régulier et aisé garantissent qu'aucune surface n'abrite de contaminants résiduels. En outre, la possibilité de visualiser et de modifier simultanément les paramètres pendant le fonctionnement de l'agitateur est bénéfique pour assurer le contrôle de la qualité. Une note intelligente1 consacrée aux considérations importantes à prendre en compte lors de l'évaluation d'un grand agitateur orbital pour la production d'ADN plasmidique est disponible.
Les suspensions doivent être agitées à des vitesses et avec des orbites différentes en fonction du récipient de culture et du type de cellules, d'où l'importance de choisir l'agitateur orbital adapté à votre application.2 D'autres éléments, tels que l'installation correcte de l'agitateur, les meilleures pratiques en matière de fonctionnement et de production de cellules, les processus de nettoyage et de désinfection, ainsi qu'une maintenance préventive régulière, sont également essentiels pour accroître la reproductibilité expérimentale. 3 Thermo Fisher Scientific a toujours une longueur d'avance et a investi beaucoup de temps et de ressources afin d'optimiser les protocoles les plus nécessaires (par exemple, la production d'ADN plasmidique dans E. coli4), vous n'avez donc pas besoin de le faire. Vous pouvez accroître l'efficacité et en même temps la reproductibilité expérimentale en testant et éventuellement en mettant en œuvre ces protocoles dans votre laboratoire.
D'autres activités essentielles à la préparation de l'ADN plasmidique sont le culottage des cellules bactériennes et l'extraction et la purification des plasmides. Dans un cadre universitaire, la centrifugation reste le moyen le plus populaire et le plus rentable d'exécuter ces étapes. Par exemple, l'ADN plasmidique peut être isolé dans un gradient de chlorure de césium, mais cette méthode nécessite une ultracentrifugeuse telle que la Thermo Scientific™ Sorvall™ WX+ et utilise du bromure d'éthidium. Alternativement, les kits de colonnes de gravité ou de spin peuvent purifier efficacement l'ADN plasmidique dans les supercentrifugeuses et les microcentrifugeuses. Pour augmenter la reproductibilité de votre protocole, une Thermo Scientific™ Centrifugeuse grande vitesse Sorvall™ LYNX 6000 et des Thermo Scientific™ Fiberlite Rotors en fibre de carbon peuvent être utilisés de concert avec des kits de préparation d'ADN disponibles dans le commerce pour obtenir de l'ADN plasmidique de haute qualité à grande échelle (environ 1mg). Il est également possible d'utiliser une méthode moins coûteuse sans utiliser de kit. Les deux protocoles ont été optimisés et les recommandations sont facilement accessibles sous la forme d'une note d'application.5 En outre, Thermo Fisher Scientific fournit des manuels d'utilisation complets pour tous ses modèles de centrifugeuses, comme pour la LYNX,6 qui comprennent des recommandations de désinfection, de décontamination, d'autoclavage et d'entretien qui peuvent être traduites sans effort en procédures d'exploitation étape par étape. Ainsi, vous pouvez non seulement prolonger la durée de vie d'une centrifugeuse, mais aussi augmenter le taux de réussite et la reproductibilité de vos procédures d'extraction de plasmides. En outre, si vous envisagez de passer à l'avenir d'opérations de recherche à un environnement réglementé par les BPL/BPF, alors le Thermo Scientific™ Centri-Log™ Plus Data Management Logiciel7 peut être intégré aux centrifugeuses Sorvall™ LYNX afin de permettre une collecte et une traçabilité précises des données conformément aux règles 21 CFR Part 11 relatives à l'enregistrement électronique des données.
Production de vecteurs viraux
Le développement et l'optimisation de votre plateforme de production lentivirale afin de créer des protocoles de transfection robustes peuvent s'avérer très délicats, en particulier lorsque le rendement élevé, l'évolutivité et la reproductibilité sont vos priorités. Tous les composants, y compris les milieux, les réactifs de transfection, les suppléments et les cellules, doivent fonctionner en parfaite synergie pour générer des particules lentivirales supérieures et fonctionnelles. Les applications de recherche, telles que la création de nouvelles thérapies géniques, dépendent fortement d'une croissance cellulaire de haute qualité. L'utilisation d'une culture adhésive ou en suspension pour les cellules de production virale HEK 293 en est un exemple illustratif. Si les cellules ne sont pas cultivées dans des conditions optimales, la lecture expérimentale et la reproductibilité seront affectées de manière difficile à détecter.
Les attributs de qualité du produit cellulaire final, les particules virales, peuvent varier considérablement en fonction des conditions de culture maintenues dans l'incubateur CO2. En fait, le débit de culture reproductible peut être considérablement affecté par la mise en œuvre de différentes caractéristiques et technologies dans la conception des incubateurs à CO2. Comme les cellules réagissent à des indices différents ou changeants, il est essentiel que les conditions dans la chambre de culture soient uniformes de haut en bas et d'un côté à l'autre, de sorte que toutes les cellules soient soumises aux mêmes conditions. Il est encore plus important que l'incubateur retrouve rapidement les conditions souhaitées après l'ouverture de la porte, afin que les cellules passent le maximum de temps dans leurs paramètres idéaux, ce qui accélère le temps de doublement et contribue à garantir la qualité. Les conditions idéales pour la santé et la croissance des cellules ne sont pas seulement liées à la température, car le niveau de CO2, le niveau d'oxygène et l'humidité relative (HR) sont également importants, car ils jouent tous un rôle dans la santé des cellules. Un incubateur qui garantit l'uniformité et une récupération rapide comme les incubateurs Thermo Scientific™ Heracell™ VIOS CO2 et Forma™ Steri-Cycle™ CO2 contribuera à accroître la reproductibilité d'un lot à l'autre. En outre, Thermo Fisher Scientific fournit des informations sur les meilleures pratiques pour l'entretien et la maintenance appropriés de votre incubateur de culture cellulaire, y compris des conseils sur l'installation et le positionnement dans le laboratoire, la réduction de la contamination et les procédures de désinfection, ainsi que des recommandations sur l'utilisation du bon type d'eau. Tout cela dans le but de vous aider à obtenir des résultats expérimentaux de qualité qui vous permettront de faire des découvertes.8,9
Si vous cultivez vos cellules HEK 293 de production lentivirale en suspension, il peut être utile d'utiliser un agitateur orbital résistant au CO2 de faible encombrement. Idéaux pour une utilisation dans un incubateur CO2, ces agitateurs sont dotés de composants mécaniques spécialement traités, conçus pour résister à 20 % de CO2 et à 95 % d'humidité. En comparaison, la plupart des agitateurs orbitaux à ciel ouvert ne sont pas conçus pour résister aux conditions acides d'une chambre à CO2 et doivent être remplacés régulièrement. Les Thermo Scientific™ Agitateurs et emballages résistants au CO2 sont également conçus pour dissiper un minimum de chaleur, afin de garantir que les conditions à l'intérieur de la chambre d'incubation CO2 ne sont pas affectées. Le choix d'un agitateur orbital adapté à votre application peut prolonger sa durée de vie et garantir le maintien de conditions de croissance optimales et la reproductibilité des résultats de culture.
Conclusions
Il existe de nombreux exemples d'équipements de laboratoire présents dans la recherche en thérapie génique auxquels vous ne pensez peut-être pas, mais qui ont un impact potentiel important sur la reproductibilité de vos résultats expérimentaux. La leçon essentielle à retenir est de prêter plus d'attention et de consacrer plus de temps à se familiariser avec les recommandations des fournisseurs, telles qu'elles figurent dans les manuels d'utilisation et diverses notes techniques. Dans le cadre de la recherche expérimentale, il est courant de se concentrer principalement sur des protocoles expérimentaux spécifiques, en négligeant les recommandations spécifiques relatives à l'installation et au positionnement correct des équipements, ainsi qu'à l'entretien et à la maintenance préventive, à la prévention de la contamination, au nettoyage et à la désinfection. N'oubliez pas que même les équipements de laboratoire tels que les enceintes de sécurité biologique, les centrifugeuses, les incubateurs, les agitateurs, les réfrigérateurs et les congélateurs doivent être traités avec respect et beaucoup d'attention. Il doit devenir un partenaire dans votre démarche visant à rendre vos expériences à la fois plus fructueuses et plus reproductibles.
References
1 Thermo Scientific. Smart Note: Orbital Shakers-Which Features are Important Considerations When Evaluating a Large Orbital Shaker for Production of Plasmid DNA Encoding Viral Vectors, for Applications Including CAR-T, Gene Therapy, or Other Genetic Engineering? https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LPD/Product-Information/Orbital-Shakers-DNA-Encoding-SmartNote-SNORBSHAKERDNA-EN.pdf
2 Thermo Scientific. Application Note: Choosing the Right Orbital Shaker for Your Application. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D20064.pdf
3 Thermo Scientific. Application Note: Orbital Shaker Benchmarks-Best Practices for Use and Maintenance. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/Orbital-Shaker-Benchmarks-Best-Practices-App-Note-ANMAXQBEST.pdf
4 Thermo Scientific. Application Note: Optimisation de la production d'ADN plasmidique chez Escherichia coli à l'aide de l'agitateur empilable Thermo Scientific MaxQ 8000. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D19993~.pdf
5 Thermo Scientific. Application Note: DNA Preparation Using the Thermo Scientific Sorvall LYNX Superspeed Centrifuge Series. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D21231.pdf
6 Thermo Scientific. Instruction Manual: Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000/6000 Superspeed Centrifuge. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLED%2Fmanuals%2F50136519-h-Thermo%20Scientific%20Sorvall%20LYNX-en.pdf
7 Thermo Scientific. Logiciel Centri-Log Plus : Une solution de gestion des données précise et fiable. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLPD%2Fbrochures%2FCentriLog-Plus-Brochure-GLOBAL-FNL-FWR-1.pdf
8 Thermo Scientific. Note technique : entretien et maintenance appropriés d'un incubateur de culture cellulaire. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Warranties/TNCO2CAREFEED-EN.pdf
9 Thermo Scientific. Smart Note: CO2 Incubators-Smart Water for Your CO2 Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/brochures/CO2-Incubator-Water-SmartNote-EN.pdf
