Production à grande échelle de vecteurs lentiviraux par transfection transitoire
Par Matthew Weston
Qu'est-ce que les vecteurs lentiviraux ?
Les vecteurs lentiviraux (LV) sont utilisés pour le transfert de gènes dans les applications de thérapie cellulaire et génique.[1] Leur sécurité et leur efficacité dans les traitements cliniques ont été démontrées et, en 2022, ils étaient utilisés dans plus de 100 essais cliniques en cours dans le monde entier pour la modification ex vivo de cellules ou la thérapie in vivo.[2] En effet, en raison de cette popularité et de l'approbation récente de certaines thérapies CAR-T, le marché de la production de LV devrait atteindre 800 millions de dollars d'ici 2026.[3] Parmi les domaines de traitement notables figurent les maladies héréditaires telles que la ß-thalassémie[4] ou la maladie de Parkinson. [5]
"En raison de la popularité de ces essais cliniques et de l'approbation récente de certaines thérapies CAR-T, le marché de la production de LV devrait atteindre 800 millions de dollars d'ici 2026."
La nécessité d'une mise à l'échelle
Au fur et à mesure que l'utilisation des LVs dans les nouvelles thérapies a augmenté, le besoin de technologies permettant d'accroître leur fabrication s'est également fait sentir. Actuellement, la production à grande échelle de LV est généralement réalisée en amplifiant directement les méthodes de production à petite échelle, par exemple en augmentant la surface de culture par l'ajout d'unités de culture/production supplémentaires (ou "mise à l'échelle"). Il y a donc un intérêt considérable à déterminer la meilleure configuration d'équipement pour une production optimale, et XIAOFAN ET RUI ont étudié la production de LV en utilisant le Corning™ HYPERStack™ Cell Culture Vessel,[1] qui est doté de la technologie propriétaire High Yield PERformance (HYPER) de Corning. Dans leur rapport, trois récipients Corning™ sont utilisés à des fins de comparaison : un flacon de surface CellBIND™ T-25, une chambre de culture CellBIND™ CellSTACK™ à 2 couches et un récipient de culture cellulaire HYPERStack™ à 12 couches.
"La production à grande échelle de LV est actuellement généralement réalisée en amplifiant directement les méthodes de production à petite échelle, par exemple en étendant la surface de culture par l'ajout d'unités de culture/production supplémentaires (ou "scaling-out")."
Comparaison des récipients de culture cellulaire
Les cellules 293T (ATCC CRL-3216) ont été cultivées dans du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec du sérum bovin fœtal (FBS) et un antibiotique/antimycosique, ensemencées dans les flacons de comparaison et cultivées pendant une nuit avant la transfection. Un système d'ADN à trois plasmides a été préparé et les conditions de transfection ont été optimisées à l'aide de méthodes mathématiques.[6] Le mélange de complexes de transfection a été préparé et laissé reposer pendant un court laps de temps avant l'ajout de milieu frais. L'ancien milieu dans les récipients de comparaison a été éliminé, le mélange de transfection a été ajouté et les récipients ont été incubés dans des conditions contrôlées. Les surnageants ont été récoltés et du milieu frais a été ajouté à 48h puis à 72h, et les extraits ont été combinés. Les populations de cellules 293T en croissance ont été ensemencées sur des plaques à 12 puits, incubées, et le surnageant contenant des LV a été ajouté. Après une nouvelle incubation, les titres de LV ont été quantifiés par analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (Figure 1).
Les titres de LV ont été quantifiés par analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (Figure 1).
Après production et titrage, la cuve HYPERStack™ à 12 couches a permis d'obtenir des rendements de 2,9 x 107 TU/mL et de 1,2 x 107 TU/cm2, dans lesquels le titre total a atteint 7,5 x 1010 TU. Les volumes unitaires et les rendements surfaciques des flacons CellSTACK™ à 2 couches et des flacons T-25 étaient plus faibles (figure 2).
"Le récipient Corning™ HYPERStack™ a été comparé à des récipients de culture traditionnels, révélant que le récipient HYPERStack™ peut produire un titre de LV supérieur."
Avantages de Corning™ HYPERStack™
La cuve de culture cellulaire Corning™ HYPERStack™ combine le meilleur de deux produits - les cuves de culture cellulaire Corning™ CellSTACK™ et HYPERFlask™.[7]La technologie HYPER comporte un film unique ultra-mince perméable aux gaz pour éliminer l'espace d'air à l'intérieur de la cuve. Il en résulte une augmentation substantielle de la surface de croissance cellulaire par rapport aux récipients traditionnels à couches empilées d'encombrement cubique comparable. L'utilisation de la technologie HYPER dans l'empreinte spatiale du CellSTACK™ offre un récipient de culture cellulaire efficace et évolutif pour la culture de cellules adhérentes.
De la production de vaccins à vecteur viral à la thérapie par cellules souches, les récipients Corning™ HYPERStack™ offrent de nombreux avantages, notamment :
Les récipients HYPERStack™ offrent de nombreux avantages.
- Rendements cellulaires totaux plus élevés - jusqu'à 5 fois la surface de croissance d'un récipient de culture cellulaire traditionnel d'encombrement comparable
- Morphologie, phénotype et croissance cellulaires similaires à ceux des récipients traditionnels
- Conception de système fermé idéale pour les cellules à grande échelle, les protéines thérapeutiques, la thérapie par cellules souches, les vésicules extracellulaires, les vaccins et la production de virus, y compris ceux qui ciblent le COVID-19
- Produit évolutif avec des offres de tailles multiples pour prendre en charge la mise à l'échelle et l'extension
- Assemblage innovant et conception ergonomique
- Moins de déchets volumétriques - offre un volume de média fixe de 0,2 mL/cm2 remplit
Les résultats de l'étude sont disponibles en anglais seulement.
Matthew Weston est spécialiste du contenu chez Fisher Scientific UK.
Références
[1] Xiaofan T, Rui C. Transfection transitoire à grande échelle pour la production de vecteurs lentiviraux à l'aide de la cuve de culture cellulaire Corning™ HYPERStack™ : Application Note. Corning Inc. 2022. https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-AN-669.pdf.
[2] Milone MC, O'Doherty U. Utilisation clinique des vecteurs lentiviraux. Leukemia 2018 ; 32 : 1529-1541. Doi: 10.1038/s41375-018-0106-0.
[3] Southey F. Oxford BioMedica capturera 25 à 30 % du marché des vecteurs lentiviraux d'ici 2026, prédit le CTO. Dec 10, 2018. Consulté sur le site www.biopharma-reporter.com/Article/2018/12/10/Oxford-BioMedicato-capture-25-30-of-lentiviral-vector-market-by-2026-predicts-CTO.
[4] Cavazzana-Calvo M, et al. Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human ß-thalassaemia. Nature 2010 ; 467 : 318-322. Doi : 10.1038/nature09328.
[5] Palfi S, et al. Long-Term Safety and Tolerability of ProSavin, a Lentiviral Vector-Based Gene Therapy for Parkinson's Disease : A Dose Escalation, Open-Label, Phase 1/2 Trial. Lancet 2014 ; 383 : 1138-1146. Doi: 10.1016/S0140-6736(13)61939-X.
[6] Yuan W, Chen J, et al. Comparative Analysis and Optimization of Protocols for Producing Recombinant Lentivirus Carrying the anti-Her2 Chimeric Antigen Receptor Gene (Analyse comparative et optimisation des protocoles de production de lentivirus recombinants portant le gène du récepteur d'antigène chimérique anti-Her2). J Gene Med 2018 ; 20(7-8) : e3027. doi : 10.1002/jgm.3027.
[7] Corning™ HYPERStack™ Cell Culture Vessels : Multipliez vos cellules, pas votre travail. Corning Inc. 2023. www.corning.com/emea/en/products/life-sciences/products/bioprocess/hyper-platforms/hyperstack-platform.html.
