L'isolement et la purification de l'ARN sont des étapes cruciales en biologie moléculaire pour étudier l'expression génétique, séquencer l'ARN ou réaliser d'autres applications en aval. Voici quelques méthodes courantes utilisées pour l'isolement et la purification de l'ARN :

• Extraction au phénol-chloroforme (réactif TRIzol) : Utilise le phénol et le chloroforme pour séparer l'ARN des autres composants cellulaires
• Purification par colonne à membrane de silice : Utilise des colonnes de centrifugation avec des membranes de silice pour lier et éluer l'ARN
• Purification par billes magnétiques : Utilise des billes magnétiques recouvertes de molécules de liaison à l'ARN pour le haut débit et l'automatisation
• Ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium : Sépare l'ARN en fonction de la densité via l'ultracentrifugation

Sélection Poly(A) :

• Chromatographie sur cellulose Oligo(dT) : Isole l'ARNm en se liant à sa queue poly(A)
• Billes magnétiques Oligo(dT) : Similaire à la chromatographie sur cellulose mais utilise des billes magnétiques
• Précipitation au chlorure de lithium : Précipite sélectivement l'ARN de haut poids moléculaire
• Digestion enzymatique (traitement à la DNase) : Élimine la contamination par l'ADN en digérant l'ADN avec la DNase

Chacune de ces méthodes présente des avantages et des inconvénients en termes de rendement, de pureté, de simplicité et de compatibilité avec différents types d'échantillons et d'applications en aval. Le choix de la méthode dépend souvent des exigences spécifiques de l'expérience et du type d'échantillon traité.

L'isolement de l'ARN implique une variété de produits chimiques pour lyser les cellules, inhiber les ARNases et séparer l'ARN des autres composants cellulaires. Voici quelques produits chimiques couramment utilisés dans l'isolement de l'ARN :

• Thiocyanate de guanidinium : Un agent chaotrope qui dénature les protéines et protège l'ARN de la dégradation par les ARNases. Présent dans des réactifs comme TRIzol
• Phénol : Utilisé dans l'extraction au phénol-chloroforme pour dénaturer les protéines et les séparer de l'ARN
• Chloroforme : Mélangé avec du phénol pour créer un système biphasique qui sépare l'ARN dans la phase aqueuse
• Isopropanol ou éthanol : Utilisé pour précipiter l'ARN de la phase aqueuse après extraction
• Acétate de sodium : Souvent ajouté à la phase aqueuse pour aider à précipiter l'ARN lors de la précipitation par alcool
• DNase I : Une enzyme utilisée pour digérer l'ADN contaminant dans les préparations d'ARN
• Réactif TRIzol : Une solution commerciale contenant du thiocyanate de guanidinium, du phénol et d'autres composants pour l'extraction de l'ARN
• Tampons à membrane de silice : Tampons contenant des sels chaotropes (comme le chlorure de guanidinium) et de l'éthanol utilisés dans la purification de l'ARN par colonne de silice
• Chlorure de lithium : Utilisé pour la précipitation sélective de l'ARN, en particulier l'ARN de haut poids moléculaire
• Billes magnétiques : Recouvertes d'oligo(dT) ou d'autres molécules pour lier l'ARN, utilisées dans les méthodes de purification par billes

Ces produits chimiques sont essentiels pour isoler et purifier efficacement l'ARN tout en empêchant sa dégradation et sa contamination.

Éviter la contamination par l'ADN lors de l'isolement de l'ARN est crucial pour garantir la pureté de l'échantillon d'ARN. Voici plusieurs stratégies pour minimiser la contamination par l'ADN :

1. Après l'isolement de l'ARN, traitez l'échantillon avec de la DNase pour dégrader tout ADN restant. Des kits commerciaux de DNase sans RNase sont disponibles à cet effet.
2. Utilisez des agents dénaturants puissants comme le thiocyanate de guanidinium pendant l'étape de lyse cellulaire. Ces agents aident à dénaturer les protéines, y compris les nucléases qui pourraient dégrader l'ARN.
3. Travaillez dans un environnement propre et utilisez du matériel et des réactifs stériles et sans RNase. Évitez la contamination croisée en changeant fréquemment de gants et en utilisant des pipettes et des pointes dédiées.
4. Suivez des protocoles qui incluent des étapes de précipitation sélective de l'ARN tout en éliminant l'ADN. Les étapes de précipitation à l'éthanol et à l'isopropanol peuvent aider à purifier l'ARN.
5. Les kits commerciaux d'isolement de l'ARN sont conçus pour minimiser la contamination par l'ADN. Ces kits incluent souvent des étapes de liaison et de lavage sélectifs de l'ARN.
6. Lors de l'utilisation de méthodes d'isolement basées sur des colonnes, ne surchargez pas les colonnes avec trop d'échantillons, car cela peut entraîner une élimination incomplète de l'ADN.
7. Effectuez occasionnellement des isolations factices (sans échantillons) pour vous assurer que vos réactifs et votre matériel ne sont pas contaminés par l'ADN.
8. Après l'isolement, vérifiez la contamination par l'ADN en utilisant la PCR ciblant une séquence d'ADN spécifique. Si une amplification se produit, cela indique la présence de contamination par l'ADN.

En suivant ces étapes, vous pouvez réduire considérablement le risque de contamination par l'ADN dans vos échantillons d'ARN.