Séquençage de l'ADN

Voici les exigences de base pour le séquençage de l'ADN :

• Modèle d'ADN : L'échantillon d'ADN que vous souhaitez séquencer.
• Amorces : Courts fragments d'ADN qui initient le processus de séquençage.
• ADN polymérase : Une enzyme qui synthétise de nouveaux brins d'ADN complémentaires au brin modèle.
• Nucléotides :
  • dNTPs : Nucléotides standard.
  • ddNTPs : Nucléotides modifiés utilisés pour la terminaison de chaîne dans le séquençage de Sanger.
• Machine de séquençage : Équipement qui lit la séquence des nucléotides dans l'ADN.
• Tampon et réactifs : Solutions chimiques qui fournissent les conditions nécessaires pour que l'ADN polymérase fonctionne.
• Thermocycleur (pour certaines méthodes) : Une machine utilisée pour amplifier les segments d'ADN par réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Ces composants sont essentiels pour la plupart des protocoles de séquençage de l'ADN, bien que des méthodes spécifiques puissent avoir des exigences supplémentaires.

La quantité d'ADN nécessaire pour le séquençage dépend de la méthode de séquençage et de la plateforme que vous utilisez. Voici quelques directives générales :

• Séquençage Sanger :

  • Requiert généralement 10-50 ng d'ADN purifié par réaction.

• Séquençage de nouvelle génération (NGS) :

  • Séquençage Illumina : Requiert généralement de 1 ng à 1 µg d'ADN, selon le protocole spécifique de préparation de la bibliothèque.
  • Séquençage Ion Torrent : Requiert généralement environ 10 ng à 1 µg d'ADN d'entrée.
  • Séquençage Pacific Biosciences (PacBio) : Requiert généralement de 0,5 à 5 µg d'ADN de haute qualité.
  • Séquençage Oxford Nanopore : Requiert environ 200 ng à 1 µg d'ADN, bien que certains protocoles puissent fonctionner avec aussi peu que 10 ng.

• Séquençage de troisième génération :

  • Séquençage en temps réel de molécules uniques (SMRT) (PacBio) : Requiert souvent de 0,5 à 5 µg d'ADN de haut poids moléculaire.
  • Séquençage Nanopore (Oxford Nanopore) : Requiert généralement environ 200 ng à 1 µg d'ADN, bien que certains protocoles puissent utiliser des quantités plus faibles.

Ces quantités peuvent varier en fonction des protocoles et des kits spécifiques, il est donc important de consulter les directives fournies par le fabricant de la plateforme de séquençage et du kit de préparation de la bibliothèque que vous utilisez.

Le séquençage de Sanger et le séquençage de nouvelle génération (NGS) sont deux méthodes différentes pour déterminer la séquence des nucléotides dans l'ADN. Voici les principales différences entre elles :

Séquençage de Sanger

• Méthode : Terminaison de chaîne avec des ddNTPs et électrophorèse capillaire.
• Longueur de lecture : Longue (500-1000 pb).
• Débit : Faible; séquence un fragment à la fois.
• Précision : Très élevée.
• Applications : Séquençage à petite échelle (par exemple, gènes uniques), validation de variantes.
• Coût : Plus élevé par base mais coûts d'installation plus bas pour les petits projets.

Séquençage de nouvelle génération (NGS)

• Méthode : Séquençage massivement parallèle de millions de fragments.
• Longueur de lecture : Courte à longue (100-300 pb pour Illumina, plus longue pour PacBio/Oxford Nanopore).
• Débit : Élevé; séquence des génomes entiers, des exomes ou des transcriptomes.
• Précision : Élevée, mais varie selon la plateforme.
• Applications : Séquençage à grande échelle (par exemple, génomes entiers, exomes, RNA-Seq, séquençage ciblé).
• Coût : Plus bas par base mais coûts d'installation plus élevés; rentable pour les grands projets.

Le séquençage de Sanger est idéal pour les projets de séquençage à petite échelle en raison de sa haute précision et de ses longueurs de lecture plus longues. Il est plus coûteux par base mais a des coûts d'installation plus bas pour les petits projets. Le NGS est adapté aux projets de séquençage à grande échelle grâce à son débit élevé et sa capacité à séquencer simultanément des millions de fragments. Il est plus rentable par base pour les grands projets mais nécessite des ressources bioinformatiques importantes pour l'analyse des données.